幽門螺桿菌卵黃抗體的研制及其功能的初步評(píng)價(jià).pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的最常見(jiàn)的病原,也是引起胃癌發(fā)生的關(guān)鍵因素?？股氐亩嗦?lián)治療對(duì)消除Hp的感染有較好的療效,然而抗生素治療在體內(nèi)仍不能完全有效,而且極易產(chǎn)生抗藥性。因此,探討其它的治療途徑是一種必然的研究趨勢(shì)。本研究以Hp為材料,采用不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和保存,并制備成完全抗原對(duì)剛開(kāi)產(chǎn)或開(kāi)產(chǎn)不久的母雞進(jìn)行免疫,用凝集試驗(yàn)法測(cè)定其抗體效價(jià),并對(duì)免疫接種Hp母雞免疫應(yīng)答規(guī)

2、律和卵黃抗體的抑菌活性及理化特性等做了初步探討,這為制備高含量的抗Hp免疫卵黃及相關(guān)的生物制劑提供技術(shù)依據(jù),也為雞蛋及免疫蛋的開(kāi)發(fā)利用和深入研究提供借鑒。
　　 1.幽門螺桿菌的培養(yǎng)與保存
　　 本試驗(yàn)采用不同培養(yǎng)基對(duì)Hp進(jìn)行培養(yǎng)和保存,結(jié)果表明:固體培養(yǎng)Hp,培養(yǎng)基為哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)加混合抗生素(10mg·L-1鹽酸萬(wàn)古霉素+10mg·L-1兩性霉素B+2500iu·L-1多粘菌素B+5mg·L-1甲氧芐胺嘧啶),并分

3、別添加6％脫纖維綿羊血、6％馬血清,在5％O2,10％CO2,85％N2的微需氧條件下,37℃培養(yǎng)3d,均可培養(yǎng)出Hp;嚴(yán)格無(wú)菌的條件下,不添加混合抗生素,對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響,且不會(huì)造成雜菌污染。液體培養(yǎng)Hp,布氏肉湯基礎(chǔ)中加入混合抗生素和6％馬血清,Hp增菌迅速,但如不及時(shí)更換新鮮的微需氧環(huán)境,極易形成球形體。菌株采取冷凍保存液法保存于-70℃～-80℃低溫條件下6個(gè)月,可以成功復(fù)蘇,且復(fù)蘇率可達(dá)100％。
　　 2.抗幽門

4、螺桿菌卵黃抗體的制備及其體外抑菌試驗(yàn)
　　 以Hp全菌滅活抗原對(duì)150日齡伊沙褐殼母雞進(jìn)行首免,165日齡二免,180日齡三免,于首免后即開(kāi)始收集雞蛋,采用凝集試驗(yàn)法測(cè)定卵黃中的抗體效價(jià)。結(jié)果表明:每間隔15d,采取兩次加強(qiáng)免疫方法,可有效的引起免疫應(yīng)答。母雞在初免45d后,抗體效價(jià)最高可達(dá)到1:1024,抗體效價(jià)大于1:128可維持60d以上,然后抗體效價(jià)呈緩慢下降趨勢(shì),經(jīng)130d后,抗體效價(jià)下降至1:8。體外抑菌試驗(yàn)表明,高

5、免卵黃抗體具有明顯的抑制Hp生長(zhǎng)的活性。
　　 3雞抗幽門螺桿菌卯黃抗體的理化特性
　　 對(duì)雞抗幽門螺桿菌高免卵黃抗體的理化特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:pH值、溫度對(duì)其活性的影響較明顯,胃蛋白酶則加強(qiáng)了這一作用。在pH值單獨(dú)影響下,pH≤3為其敏感區(qū),如果同時(shí)存在胃蛋白酶,則其敏感區(qū)為pH≤4,在巴氏消毒溫度條件下其具有較好的熱穩(wěn)定性,這對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)卵黃抗體具有非常重要的意義。
　　 4幽門螺桿菌感染蒙古沙土鼠疾

6、病模型的建立
　　 利用蒙古沙土鼠建立Hp NCTC11637株胃內(nèi)感染模型。感染方法有兩種,方法Ⅰ是沙土鼠禁食18h后用50％酒精0.5mL預(yù)處理,6h后接種Hp,間隔12h、24h分別再次接種。方法Ⅱ的接種方法同方法Ⅰ,但接種后每日口服雷尼替丁5mg/kg體重。胃內(nèi)接種Hp后,于第7d、15d、35d、45d分別用Hp抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒、細(xì)菌培養(yǎng)和胃組織切片的方法觀察沙土鼠胃內(nèi)細(xì)菌感染情況和胃病理組織學(xué)變化。結(jié)果表明,給

7、沙土鼠胃內(nèi)灌服酒精以損傷胃黏膜并每日口服雷尼替丁,在人工接種35d后,胃內(nèi)見(jiàn)有多量Hp生長(zhǎng),胃組織病變與Hp自然感染的病例相似。
　　 5卵黃抗體對(duì)幽門螺桿菌感染沙土鼠的預(yù)防試驗(yàn)
　　 在成功研制出抗Hp卵黃抗體的基礎(chǔ)上,利用蒙古沙土鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,觀察抗Hp卵黃抗體對(duì)Hp感染的防制作用。實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為四組(36只/組),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別灌服生理鹽水、復(fù)合抗生素和抗Hp卵黃抗體,1次/d,連續(xù)13d。Ⅳ組皮下注射抗Hp卵

8、黃抗體,1次/d,48h后再注射1次。在首次用藥后第48h口服接種幽門螺桿菌(ATCC43504)2.75×108CFU(布氏培養(yǎng)液)。在接種后第7、15、30、45d,Ⅰ組鼠胃內(nèi)均有大量Hp定植,感染率100％;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的感染率均低于23％。結(jié)果表明灌服和注射抗Hp卵黃抗體,可以抑制沙土鼠感染ap,其抑制效果與抗生素組無(wú)明顯差異(p＜0.05)。
　　 6卵黃抗體對(duì)沙土鼠胃內(nèi)感染幽門螺桿菌的治療試驗(yàn)
　　 利用蒙古

9、沙土鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,觀察Hp特異卵黃抗體對(duì)胃內(nèi)Hp感染的治療效果。實(shí)驗(yàn)鼠間隔48h兩次口服接種Hp(ATCC43504)布氏培養(yǎng)液1ml(1.15×108CFU),首次接種7d后將實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為四組(16只/組),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別灌服生理鹽水、復(fù)合抗生素和抗Hp卵黃抗體,1次/d,連續(xù)12d;Ⅳ組間隔48h皮下注射抗Hp卵黃抗體兩次。在用藥前實(shí)驗(yàn)鼠胃內(nèi)均有大量Hp定植,感染率100％;用藥后第7d,II組鼠的Hp清除率為60％;Ⅲ組、Ⅳ

10、組鼠胃內(nèi)均有少量Hp存在。用藥12d后,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的胃內(nèi)Hp清除率分別為60％、60％、40％。灌服和注射抗Hp卵黃抗體,可以抑制沙土鼠胃內(nèi)Hp感染,其抑制效果與抗生素相似。
　　 7幽門螺桿菌UreB基因的克隆及原核表達(dá)
　　 為研制幽門螺桿菌基因工程疫苗或?yàn)橹苽渎腰S抗體提供免疫原,以原核載體表達(dá)幽門螺桿菌的保護(hù)性抗原成分UreB蛋白。PCR方法擴(kuò)增UreB基因片段,將其克隆至pGEM-T Easy,測(cè)序證明UreB