表達口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1重組牛皰疹病毒1型的構(gòu)建及其免疫研究.pdf

1、牛皰疹病毒Ⅰ型（Bovine herpesvirus type1，BIN-1）和口蹄疫病毒（Foot and mouthdi sease virus，F(xiàn)MDV）均為牛重要病原，呈世界性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。BHV-1基因組約為138 kb的雙鏈DNA，含有多個病毒復(fù)制非必需基因，可允許外源基因的插入，是構(gòu)建多價牛傳染病疫苗的理想載體。2005年在我國數(shù)省區(qū)爆發(fā)FMDV Asial，造成了巨大的經(jīng)濟損失。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1

2、能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，是研究FMD基因工程疫苗的首選蛋白。
　　 本研究人工合成了Asial IND49197（GenBank AY687334.1）VP1全基因，對VP1基因進行了原核表達并制備特異性的多克隆抗體。首先利用PCR方法擴增獲得VP1全基因，將其克隆至原核表達載體pET-30a（+）中，在大腸桿菌BL21中進行表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示表達產(chǎn)物分子量約為31.6 ku，以包涵體形式存在。通過Ni-N

3、TA Purlfication System純化后進行Western blotting與間接ELISA分析，結(jié)果顯示重組蛋白能夠被FMD陽性血清識別，具有良好的反應(yīng)性。將純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，該抗體ELISA效價為1:20480，瓊脂免疫擴散試驗效價為1:64，病毒中和試驗效價為1:64。
　　 在構(gòu)建表達FMDV Asial VP1重組BIN-1時，利用前期已經(jīng)構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pGEMT-gE-/LacZ

4、+，該載體含有在巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）早期啟動子和BGH PolyA調(diào)節(jié)信號控制下的LacZ報告基因，同時含有BHV-1同源重組上下游臂，并利用人工合成含有VP1全基因質(zhì)粒pUC57一AsiaVP1。以限制性內(nèi)切酶XabⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒pGEM T-gE-/LacZ+和pUC57-AsiaVP1，通過回收目的片段、連接和轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段用VP1基因替換掉LacZ基因，最終獲得含VP1表達盒且gE基因缺失

5、的轉(zhuǎn)移載體。采用磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將該轉(zhuǎn)移載體與前期獲得的gE基因缺失并表達LacZ基因的重組病毒rBHV-1/gE-/LacZ+基因組DNA共轉(zhuǎn)染牛鼻甲細胞，采用反向病毒蝕斑篩選，獲得表達VP1基因的重組病毒rBHV-1/gE-/AsiaVPI。PCR鑒定結(jié)果表明VP1基因成功重組到rBHV-1/gE-/AsiaVP1基因組中，間接免疫熒光試驗和Western blotting證實VP1基因在rBIN-1/gE-/AsiaVP1感染的細

6、胞中獲得了表達。在MDBK細胞中連續(xù)傳25代，PCR鑒定結(jié)果表明VP1基因在rBHV-1/gE-/AsiaVP1中穩(wěn)定存在。rBHV-1/gE-/AsiaVP1與親本病毒rBHV-1/gE-/LacZ+的TCID50測定結(jié)果分別是108.43/mL、108.33/mL，表明他們之間的增殖能力差別相似。
　　 將15只2kg～3kg的健康新西蘭白兔隨機分成三組分別于頸部皮下注射1 ml108.33 TCID50/mL rBHV-1

7、/gE-/LacZ+，1ml108.33 TCID50/mL rBHV-1/gE-/AsiaVP1和未免疫對照組，首免3周后以同樣劑量加強免疫一次。6周后用IBRV強毒（IBRV/JL06）滴鼻攻毒，每只兔子劑量為0.5 ml107.67 TCID50/mL。IBRV中和抗體檢測結(jié)果表明首免后1周可產(chǎn)生1:4～1:16不等的抗體，加強免疫后抗體滴度均能達到1:128，并一直持續(xù)到本實驗結(jié)束（8周），rBIN-1/gE-/AsiaVP1或

8、rBIN-1/gE-/LacZ+所產(chǎn)生的IBRV中和抗體滴度基本沒有差別。VP1抗體檢測表明免疫rBHV-1/gE-/AsiaVP11周后可產(chǎn)生抗VP1蛋白的ELISA抗體，效價可達1:256以上，免疫2周后抗體達到高峰，并一直持續(xù)到本實驗結(jié)束（8周）。攻毒后鼻拭子TCID50測定結(jié)果顯示經(jīng)rBHV-1/gE-/AsiaVP1或rBHV-1/gE-/LacZ+免疫的實驗動物組排毒高峰出現(xiàn)在2～3天，排毒時間可持續(xù)5天，排毒最高時的平均T

9、CID50/0.1mL分別為1.372和1.246；而未免疫實驗組排毒高峰在攻毒后的第3～5天，排毒時間可持續(xù)8天，排毒最高時的平均TCID50/0.1mL為2.643。臨床觀察結(jié)果顯示三組實驗兔在攻毒后均出現(xiàn)有呼吸道臨床癥狀如呼吸困難、精神沉郁等，但rBHV-1/gE-/LacZ+、rBHV-1/gE-/AsiaVP1免疫組比未免疫組要輕。攻毒后第6天每組安樂死2只實驗兔，對采集的心、肝、脾、肺、腎、腦和淋巴結(jié)等組織進行病理學(xué)觀察、間

10、接免疫熒光（Immunofluorescence assay，IFA）檢測和免疫組化（imunohistochemistry，IHC）檢查，結(jié)果顯示rBHV-1/gE-/AsiaVP1或rBHV-1/gE-/LacZ+免疫組比對照組組織病理變化輕，熒光強度弱，組化陽性細胞少。
　　 綜上所述，本研究原核表達了FMDV Asial VP1基因并制備了兔多克隆血清，同時構(gòu)建了VP1重組BHV-1。IBRV/JL06攻毒試驗表明該重組