A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒的開發(fā).pdf

1、口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth diseasevirus，F(xiàn)MDV）引起的高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動(dòng)物產(chǎn)生急性高熱等癥狀。該病感染能力強(qiáng)，傳播途徑多，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生過大流行，嚴(yán)重阻礙了畜牧業(yè)發(fā)展?？谔阋卟《居?個(gè)血清型，分別為O、A、C、Asia1、SAT1-3型，每個(gè)血清型又包含多個(gè)亞型，各型之間不存在交叉反應(yīng)。我國(guó)的主要流行血清型為A型、O型和A

2、sia1型。2009至2013年間，在我國(guó)上海、湖北、武漢、新疆阿克蘇地區(qū)以及周邊國(guó)家多次爆發(fā)A型口蹄疫疫情，給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)帶來了巨大的損失。
　　為建立一種有效檢測(cè)A型FMD的方法，首先需獲得具有活性的A型FMDV VP1蛋白。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到A型FMDV vp1基因片段，與原核表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-A-vp1。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)含重組質(zhì)粒pET-A-vp1的E. coliBL21（DE3）菌后，SDS-

3、PAGE及Western-Blot分析表明，A-VP1重組蛋白分子質(zhì)量約為29 ku，能夠被A型口蹄疫陽性血清特異性識(shí)別，蛋白表達(dá)正確。超聲破碎后發(fā)現(xiàn)A-VP1蛋白以包涵體形式存在。通過對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在37℃條件下，OD600為0.6，IPTG終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，A-VP1蛋白的表達(dá)量最大。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示A-VP1包涵體蛋白經(jīng)過洗滌純化，尿素濃度梯度透析復(fù)性后活性較高。A型FMDV VP1活

4、性蛋白的成功表達(dá)為進(jìn)一步研制口蹄疫基因工程疫苗和診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
　　以原核表達(dá)經(jīng)純化復(fù)性制備的A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白代替?zhèn)鹘y(tǒng)病毒抗原包被，建立快速、安全、有效的A型FMDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒。對(duì)前期制備的A-VP1蛋白進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，結(jié)果表明，A-VP1蛋白能夠特異性識(shí)別A型FMDV陽性牛血清，可作為檢測(cè)抗原建立檢測(cè)A型FMDV抗體檢測(cè)的方法。以最佳質(zhì)量濃度1 mg/LA-VP1蛋白為

5、檢測(cè)抗原，方陣滴定法確定最佳檢測(cè)血清稀釋度為1:100，最佳的酶標(biāo)二抗稀釋度為l:2000，建立A型FMDV抗體ELISA檢測(cè)方法。該方法的敏感性為94.32％，特異性為99.09％，批內(nèi)與批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%。采用該方法檢測(cè)201份臨床血清，與液相阻斷ELISA試劑盒的符合率達(dá)92.54%。以此為基礎(chǔ)組裝A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體間接 ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒特異、敏感、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便，可用來監(jiān)控 A型口蹄疫抗體水