A型口蹄疫病毒黏膜特異性sIgA抗體ELISA檢測方法的建立與應用.pdf

1、口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)主要通過呼吸道、消化道進入動物機體，黏膜系統(tǒng)是機體抵抗病原入侵的第一道防線。分泌型IgA抗體(sIgA)是黏膜免疫產(chǎn)生特異性的標志，也是黏膜免疫的主要效應因子，對機體抵抗FMDV的入侵具有極其重要的作用。本研究構(gòu)建A型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的重組表達載體，利用大腸桿菌表達純化的蛋白作為包被抗原，建立一種檢測黏膜分泌物中FMDV特異性sIgA抗體的間接EL

2、ISA方法，為監(jiān)測FMDV特異性sIgA抗體水平變化規(guī)律及黏膜免疫效果評價提供基礎方法，同時為口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD)的早期診斷提供一種新方法。具體研究內(nèi)容如下:
　　1、FMDV黏膜特異性sIgA抗體ELISA檢測抗原的制備
　　本研究構(gòu)建了pET30a-VP1原核表達載體，將重組質(zhì)粒在原核表達工程菌BL21(DE3)中進行表達，將表達的蛋白用親和層析法進行純化，用Western blo

3、t驗證其反應原性良好。表達純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測分子量為24.3ku，BCA TM法測定蛋白濃度為0.7mg/mL。
　　2、FMDV黏膜特異性sIgA抗體ELISA方法的建立
　　以純化的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1作為包被抗原，以鼠抗豬IgA單克隆抗體為二抗，辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG抗體為三抗，篩選ELISA各項最佳條件，建立A型FMDV特異性sIgA抗體間接ELISA檢測方法。結(jié)果表明ELISA

4、最佳工作條件為抗原包被濃度為3.5μg/mL，最佳封閉液為5％脫脂奶粉，鼠抗豬IgA單抗稀釋度為1∶5000，酶標記抗體稀釋度為1∶2500，樣品、二抗、三抗的作用時間都為37℃反應30 min，底物室溫顯色10 min。該方法與豬瘟(classicalswine fever, CSF)、豬繁殖與呼吸道綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、豬圓環(huán)(porcine

5、circovirus，PCV)和豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)的特異性IgA抗體沒有交叉反應，都為陰性。敏感性在95％以上，特異性在87％以上。批內(nèi)和批間重復性實驗的變異系數(shù)介于3.16％～9.76％，表明該方法具有良好的可重復性。
　　3.FMDV黏膜特異性sIgA抗體ELISA方法的臨床應用
　　用建立的ELISA方法檢測了A型FMDV攻毒-同居感染實驗豬鼻拭子樣品中特異性sI

6、gA抗體變化趨勢，同時與血清中IgG和3ABC抗體檢測結(jié)果相比較。實驗結(jié)果表明豬在感染FMD后的1天，鼻拭子中FMDV特異性sIgA抗體就能夠檢出，比血清中IgG和3ABC抗體出現(xiàn)的時間早，在監(jiān)測的第60天仍有部分樣品sIgA為陽性。盡管本研究中A型與O型交叉反應不能完全避免，但是通過調(diào)整合適的cut-off值，交叉反應能夠大大降低，從而保證了該方法具有良好的敏感性和特異性。該方法為監(jiān)測FMDV特異性sIgA抗體水平變化規(guī)律及黏膜免疫效