口蹄疫病毒RT-PCR與抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起如黃牛、豬、綿羊、山羊等偶蹄動(dòng)物感染的一種熱性、接觸性、烈性傳染病，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類重要傳染病之首。該病的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此世界各國(guó)相當(dāng)重視對(duì)該病的研究和防制。本研究主要分為三部分，即建立了FMDV的RT-PCR檢測(cè)及血清型鑒定的方法；VP2基因在大腸桿菌和桿狀病毒2種表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了正確表達(dá)，將原核表達(dá)的VP2蛋白純化后作為抗原，建立了FMDVVP2蛋白抗

2、體間接ELISA檢測(cè)方法；以原核表達(dá)純化的3ABC蛋白為抗原，建立了非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)方法，旨在鑒別診斷自然感染FMDV和疫苗免疫的牛。 第一部分，參考GenBank中3D、VP1、2A基因各個(gè)血清的標(biāo)準(zhǔn)序列，設(shè)計(jì)引物P1/P2和S1/S2。利用Trizol試劑盒提取病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)過94℃預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)(94℃變性25s，58℃退火50s，72℃延伸30s)，72℃終延伸7min，4℃終

3、止反應(yīng)，將克隆得到目的片段進(jìn)行測(cè)序，比較同源性而確定血清型。通過敏感性試驗(yàn)檢測(cè)，2對(duì)引物均可以檢測(cè)到10TCID5O的病毒量；特異性試驗(yàn)的檢測(cè)，2對(duì)引物的對(duì)正常細(xì)胞、牛黏膜病病毒、豬瘟病毒、水皰性口炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。利用該方法對(duì)病牛的流涎液體、水皰液體、舌皮組織、感染犢牛心臟等組織進(jìn)行檢測(cè)，初步結(jié)果顯示：該檢測(cè)方法可以對(duì)O型和AsiaI型FMDV進(jìn)行特異性檢測(cè)。 第二部分，將VP2基因分別克隆到原核

4、表達(dá)載體pPROEXTMHTb和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis2A，利用酶切和PCR鑒定，成功構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPR-VP2和pBL-VP2。然后，將重組的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBL-VP2，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，經(jīng)4輪噬斑篩選后，將純化的重組病毒接種于sf9細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE分析、Westernblotting和Dot-ELISA鑒定。所有結(jié)果證實(shí)：VP2基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得了正確表達(dá)。將重組質(zhì)粒pPR-V

5、P2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，經(jīng)終濃度1mmol/LIPTG誘導(dǎo)，在4h時(shí)VP2蛋白獲得最大表達(dá)量。利用Ni-NTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)對(duì)VP2蛋白進(jìn)行純化，并通過Westernblotting和Dot-ELISA方法進(jìn)行鑒定，證實(shí)VP2蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得正確表達(dá)，并得到了純化的VP2蛋白。最后，以純化的VP2蛋白為抗原，建立VP2蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)方法，通過對(duì)各個(gè)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了最佳反應(yīng)條件。 第三部分

6、，將3ABC基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，利用酶切和PCR鑒定，成功構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX-3ABC。將重組質(zhì)粒pGEX-3ABC，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)plysS中，經(jīng)終濃度1mmol/LIPTG誘導(dǎo)，在3h時(shí)3ABC蛋白獲得最大表達(dá)量。利用SDS-PAGE后切膠的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，并通過Westernblotting方法進(jìn)行鑒定，證實(shí)3ABC蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得正確表達(dá)，并得到了純化的3ABC蛋