灰葡萄孢菌抗多菌靈β-微管蛋白基因在禾谷鐮孢菌中的表達(dá)研究.pdf

1、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)是引起赤霉病最主要的病原菌之一。赤霉病不僅嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量，而且降低小麥的品質(zhì)，禾谷鐮孢菌可產(chǎn)生多種衍生真菌毒素及次生代謝物質(zhì)，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等，可引起人類和哺乳動(dòng)物中毒，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康?；移咸焰呔?Botrytis cinerea)引起的灰霉病是我國(guó)許多果樹(shù)、蔬菜、草莓、花卉等植

2、物上的重要病害，尤其在保護(hù)地生產(chǎn)的蔬菜及草莓上引起果實(shí)腐爛，損失比較嚴(yán)重。
　　 自1970年沈陽(yáng)化工研究院張少銘等實(shí)現(xiàn)多菌靈的工業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑用于赤霉病和灰霉病的防治至今已有40多年的歷史。苯并咪唑類藥劑可與植物病原真菌細(xì)胞的β-微管蛋白結(jié)合，阻止紡錘絲的形成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂，植物病原真菌在生物進(jìn)化過(guò)程中保持了微管蛋白基因的隨機(jī)突變性質(zhì)，以適應(yīng)不良的生存環(huán)境，因此植物病原真菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗

3、藥性大多是病原真菌細(xì)胞內(nèi)編碼β-微管蛋白的某些特定氨基酸發(fā)生突變，使苯并咪唑類殺菌劑與作用靶標(biāo)的親和性下降或喪失而表現(xiàn)抗藥性，并且大多數(shù)植物病原真菌田間抗性菌株的氨基酸突變一般位于β-微管蛋白的198位或200位兩個(gè)編碼位點(diǎn)?；移咸焰呔?Botrytis cinerea)β-微管蛋白198位的谷氨酸(Glu-E)突變?yōu)楸彼?Ala-A)、賴氨酸(Lys-K)或纈氨酸(Val-V)都導(dǎo)致其對(duì)多菌靈產(chǎn)生高水平抗性，或200位的苯丙氨酸(P

4、he-F)突變?yōu)槔野彼?Tyr-Y)導(dǎo)致其對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等水平抗性產(chǎn)生。禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)中存在β1和β2兩個(gè)微管蛋白基因，并且禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈不同敏感型菌株的β1-微管蛋白基因相同，沒(méi)有發(fā)生突變，而β2-微管蛋白73、167、198或200位氨基酸突變能夠?qū)е潞坦如犳呔鷮?duì)多菌靈產(chǎn)生不同水平的抗藥性，73位谷氨酰胺(Gln-Q)突變?yōu)榫彼?Arg-R)或198位谷氨酸(Glu-E)突變?yōu)榱涟彼?Le

5、u-L)導(dǎo)致禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生高水平抗藥性，167或200位苯丙氨酸(Phe-F)突變?yōu)槔野彼?Tyr-Y)導(dǎo)致禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等水平抗藥性。說(shuō)明禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗性機(jī)制不同于灰葡萄孢菌。
　　 本文采用Double-joint PCR方法體外構(gòu)建含抗藥性編碼的灰葡萄孢菌β-微管蛋白基因載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因，并進(jìn)一步敲除獲得的轉(zhuǎn)化子菌株中另外

6、的β2-微管蛋白基因或β1-微管蛋白基因，獲得抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因轉(zhuǎn)化子菌株及其β2-微管蛋白基因敲除突變體菌株、同源置換禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因轉(zhuǎn)化子菌株及其β1-微管蛋白基因敲除突變體菌株。通過(guò)半定量RT-PCR測(cè)定抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因后在禾谷鐮孢菌中的表達(dá)情況，測(cè)定禾谷鐮孢菌菌株和各轉(zhuǎn)化子菌株對(duì)多菌靈的敏感性、菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)分

7、生孢子能力、產(chǎn)子囊殼能力和致病力等生物學(xué)特性，以探明不同植物病原真菌間微管蛋白基因能否替代以及抗多菌靈灰葡萄孢菌的β-微管蛋白基因能否在禾谷鐮孢菌中表達(dá)，抗多菌靈β-微管蛋白基因、禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步揭示禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗性機(jī)制，以及多菌靈與β-微管蛋白的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。本文的主要研究結(jié)果如下所述。
　　 本文采用Double-joint PCR方法體外構(gòu)建含抗藥性編

8、碼的β-微管蛋白基因載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因，成功獲得了同源置換后的轉(zhuǎn)化子菌株，表明不同植物病原真菌間β-微管蛋白基因可以替代。
　　 通過(guò)測(cè)定抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因獲得的轉(zhuǎn)化子菌株對(duì)多菌靈的敏感性結(jié)果表明，抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因后禾谷鐮孢菌對(duì)多菌

9、靈敏感性降低，但不表現(xiàn)抗藥性。
　　 通過(guò)半定量RT-PCR測(cè)定了抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-磁管蛋白基因后在禾谷鐮孢菌中的表達(dá)水平，結(jié)果表明β-微管蛋白基因在禾谷鐮孢菌中在mRNA水平能夠表達(dá)，同源置換β1-微管蛋白基因后的表達(dá)水平和β1-微管蛋白基因相比沒(méi)有顯著差異，同源置換β2-微管蛋白基因后的表達(dá)水平和β2-微管蛋白基因相比顯著降低。
　　 通過(guò)測(cè)定抗多菌靈β-微管蛋白基因

10、同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因轉(zhuǎn)化子菌株對(duì)應(yīng)的β2-微管蛋白基因和β1-微管蛋白基因敲除突變體菌株對(duì)多菌靈的敏感性、菌絲生長(zhǎng)速率等生物學(xué)特性，結(jié)果表明禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因?qū)苟嗑`β-微管蛋白基因在禾谷鐮孢菌中的功能表達(dá)沒(méi)有抑制作用，突變體對(duì)多菌靈仍然敏感，不表現(xiàn)抗藥性。
　　 通過(guò)測(cè)定禾谷鐮孢菌野生型菌株、禾谷鐮孢菌野生型菌株的β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因敲除突變

11、體菌株、抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因的轉(zhuǎn)化子菌株及其敲除相應(yīng)微管蛋白基因的突變體菌株對(duì)多菌靈的敏感性、菌落生長(zhǎng)速率、產(chǎn)分生孢子能力、產(chǎn)子囊殼能力和致病力等生物學(xué)特性，結(jié)果表明β2-微管蛋白基因?qū)坦如犳呔潜匦璧亩?-微管蛋白基因是非必需的，但是兩者在功能上是互補(bǔ)的，抗多菌靈β-微管蛋白基因同源置換禾谷鐮孢菌β1-微管蛋白基因和β2-微管蛋白基因能夠恢復(fù)禾谷鐮孢菌有性生殖和無(wú)性生殖能