禾谷鐮菌(Fusarium graminearum)對多菌靈抗藥性分子機制的研究.pdf

1、本文克隆了禾谷鐮孢菌野生型和多菌靈抗藥性菌株的β2-磁管蛋白基因(β2-tub)全序列，明確了β2-tub突變類型與該菌對多菌靈抗藥性水平間的關(guān)系，并通過基因功能互補驗證確定β2-tub為禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性基因；進一步通過人工點突變技術(shù)研究了β2-tub雙點突變中各個突變與抗藥性的關(guān)系，探討了β1-微管蛋白基因的關(guān)鍵氨基酸的突變與抗藥性的關(guān)系及其生物學(xué)功能。
　　 以禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）

2、標準菌株P(guān)H-1的β2-微管蛋白基因(β2-mb)部分序列（genbank登錄號：FG06611.1）為參考，擴增了野生型菌株2021的β2微管蛋白基因全長eDNA序列和基因全長序列。測序結(jié)果表明，野生型菌株2021的β2-磁管蛋白基因編碼區(qū)共1713bp，含有6個內(nèi)含子，與標準菌株P(guān)H-1的β2-微管蛋白基因編碼區(qū)相比有13個核苷酸的差異；該基因可編碼477個氧基酸，其編碼的第7位氧基酸( IIe)與標準菌株P(guān)H-1(Val)有差異；

3、該β2-磁管蛋白與其它8種真菌的苯并咪唑抗藥性相關(guān)β-微管蛋白的同源性為74-77％。通過比較禾谷鐮孢菌野生型菌株和多菌靈抗藥性菌株的β2-tub序列發(fā)現(xiàn)：多菌靈中抗（MBCMR）菌株2052和R9等，β2-Tub第167位氨基酸由笨丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔籑BCMR菌株NT-7等，β2-Tub第200位氧基酸由苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?；多菌靈高抗（MBCHR）菌株JT04的β2-Tub第73位和198位氨基酸分別由谷氨酰胺和谷氨酸突變?yōu)榫彼?/p>

4、和亮氨酸；多菌靈高抗誘導(dǎo)(MBCIHR)菌株ZF43-6、ZF43-17和MBCHR菌株J2的β2-Tub第198位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?；MBCIHR菌株52-7的β2-Tub第17位和167位氨基酸分別由甘氨酸和苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸和突變?yōu)槔野彼?。半定量RT-PCR分析表明：禾谷鐮孢菌β2-tub在芽管和茵絲中表達量最高，在分生孢子和子囊孢子中的表達量次之；pl-tub在以上各階段的表達水平無明顯差異。
　　 利用PEG

5、介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因（β2-tub）敲除DNA片段“1-up:PtrpC-pht:1.2-down"分別導(dǎo)入禾谷鐮孢菌野生型菌株2021、MBCMR菌株R9和MBCHR菌株JT04，利用潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)化子，使用PCR方法快速篩選獲得了β2-tub敲除突變體。所有β2-tub敲除突變體對MBC均表現(xiàn)為超敏感，
　　 其菌絲生長速率、產(chǎn)分生孢子能力、產(chǎn)子囊殼能力及致病力均顯著下降。分別將源自禾谷鐮

6、孢菌的野生型菌株2021、MBCMR菌株R9和MBCHG菌株JT04的β2-tub回復(fù)插入至禾谷鐮孢菌β2-tub敲除體后，β2-tub回復(fù)插入突變體表現(xiàn)出與導(dǎo)入β2-tub相應(yīng)的抗藥性水平，其茵絲生長速率、產(chǎn)分生孢子能力、產(chǎn)子囊殼能力及致病力也基本恢復(fù)。結(jié)果表明，禾谷鐮孢菌β2．微管蛋白(β2-Tub)關(guān)鍵氨基酸的突變可導(dǎo)致禾谷鐮孢菌對MBC的抗藥性；β2-微管蛋白在禾谷鐮孢茵菌絲生長和繁殖過程中具有重要作用．利用體外人工點突變和兩步

7、同源置換法成功獲得了禾谷鐮孢菌β2．微管蛋白（β2-Tub）第17位氨基酸(Gly→Ser)點突變體、73位氨基酸（Gln→Arg）點突變體、167位氨基酸（Phe→Tyr）點、198位氨基酸(Glu→Leu)點突變體、第17位(Gly→Ser)和167位Phe→Tyr）氨基酸雙位點突變體、73位（Gln→Arg）和198位(Glu→Leu)氨基酸雙位點突變體和240位氨基酸( Phe→Leu)突變體。結(jié)果顯示，禾谷鐮孢菌β2-Tub第

8、17位氨基酸突變( Gly→Ser)可導(dǎo)致該菌對多茵靈的低抗，第73位氨基酸突變（Gln→Arg）不影響該菌對多菌靈的敏感性，第167位氨基酸突變（Phe→Tyr）可導(dǎo)致該菌對多菌靈中抗，第198位氨基酸突變( Glu→Leu)可導(dǎo)致該菌對多菌靈高抗，在167位氨基酸突變（Phe→Tyr）的基礎(chǔ)上，第17位氨基酸突變(Gly-Ser)可導(dǎo)致該菌對多菌靈高抗，240位氨基酸突變( Phe→Leu)可導(dǎo)致該茵對多茵靈超敏感；以上所有類型的突

9、變均對禾谷鐮孢菌的生活力無顯著影響。
　　 禾谷鐮孢菌βl-微管蛋白基因（β1-tub）并非禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因，但與β2-微管蛋白基因(β2-tub)相比，β1-tub與其它真菌中的苯并咪唑抗藥性β-微管蛋白基因的同源性更高．為更好了解禾谷鐮孢菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗性機制和禾谷鐮孢茵β1一微管蛋白(βl-Tub)生物學(xué)功能。本文使用同源重組二步置換法將βl微管蛋白第167位、第198位及第200位氨基酸進行人工點突變，

10、突變方式分別為Phe167 Tyr、Glu198Lys和Phe200 Tyr，并用二步同源置換法導(dǎo)入野生型βl-tub作為對照，用以評估基因操作對菌株的影響。結(jié)果顯示，與對照菌株相比，禾谷鐮孢菌βl-Tub第167位氨基酸突變體（Phe→Tyr）、第198位氨基酸突變體(Glu→Lys)以及第200位氨基酸突變體( Phe→Tyr)對多菌靈、苯茵靈、噻菌靈和甲基托布津的敏感性均有所下降，但生物學(xué)特性無明顯變化。禾谷鐮孢菌β1-tub敲除