禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum Schwabe兩個(gè)β-微管蛋白基因功能及對(duì)多菌靈的抗藥性分子機(jī)理.pdf

1、微管是構(gòu)成真核生物細(xì)胞骨架的主要成分，在細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中起重要作用α-和β-微管蛋白是構(gòu)成微管的主要成分，而β-微管蛋白也是多菌靈等苯并咪唑殺菌劑的作用靶標(biāo)，其特定位點(diǎn)的突變將導(dǎo)致苯并咪唑殺菌劑抗性。禾谷鐮孢菌是我國(guó)引起小麥赤霉病的主要病原菌，多菌靈是防治該病害的主要藥劑之一，但多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的作用表型及禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗性表型與其它植物病原真菌有差異。
　　 本論文通過觀察多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的細(xì)胞學(xué)尤其是有絲分裂的

2、影響，明確多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的作用機(jī)制；通過研究禾谷鐮孢菌兩個(gè)β-微管蛋白基因的敲除突變體、與GFP的融合表達(dá)突變體的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)表型、兩者在菌體不同階段的表達(dá)差異以及兩個(gè)β-微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，從而明確禾谷鐮孢菌兩個(gè)β-微管蛋白基因的關(guān)系以及在禾谷鐮孢菌生命活動(dòng)過程中的作用，確定多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的作用靶標(biāo)及禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗性的機(jī)理，從而為禾谷鐮孢菌的抗藥性治理以及以新的微管蛋白靶標(biāo)藥劑的設(shè)計(jì)提供重要的理論依據(jù)。
　　

3、 1禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)過程中核相變化及有絲分裂過程觀察
　　 本研究通過Giemsa染色觀察禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)過程中的核相變化及有絲分裂過程。觀察表明，分生孢子細(xì)胞為單核，細(xì)胞核在分生孢子細(xì)胞內(nèi)分裂后進(jìn)入芽管，在芽管內(nèi)進(jìn)行多次分裂，使芽管內(nèi)細(xì)胞核數(shù)目不斷變化。禾谷鐮孢菌有絲分裂過程可以分為4個(gè)時(shí)期，前期染色體逐漸濃縮變短，中期染色體清晰可見，后期染色單體發(fā)生分離并向相反的兩極移動(dòng)，末期形成新的子核。有絲分裂過程中染色體

4、的分離同步或不同步，不同步分離中的滯后染色體形成后期橋的現(xiàn)象更為普遍。
　　 2多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)和有絲分裂的影響
　　 已有研究結(jié)果表明多菌靈對(duì)灰葡萄孢菌Botrytis cinerea等多種真菌的作用機(jī)制是抑制有絲分裂，其β-微管蛋白發(fā)生突變是抗藥性產(chǎn)生的原因。本研究通過比較多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌和灰葡萄孢菌分生孢子萌發(fā)以及幼殖體內(nèi)有絲分裂的影響，以探明多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的作用機(jī)制以及禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗性

5、機(jī)制。
　　 禾谷鐮孢菌野生型（多菌靈敏感）菌株的分生孢子在多菌靈處理?xiàng)l件下萌發(fā)產(chǎn)生的幼殖體發(fā)生扭曲、分支增多、伸長(zhǎng)受到抑制；其分生孢子在無藥劑條件下產(chǎn)生的幼殖體在多菌靈處理?xiàng)l件下產(chǎn)生相同的特征。在藥劑處理?xiàng)l件下細(xì)胞核不能正常地進(jìn)行有絲分裂，染色體呈散亂分布。同時(shí)，染色體有絲分裂指數(shù)（CMI值）在藥劑處理后60min內(nèi)很快升高，然后又快速下降。多菌靈處理灰葡萄孢菌野生型菌株產(chǎn)生相同的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征。
　　 灰葡萄孢菌

6、多菌靈抗性菌株在藥劑處理?xiàng)l件下能進(jìn)行正常的萌發(fā)、生長(zhǎng)及有絲分裂。但是，禾谷鐮孢菌多菌靈抗性菌株在藥劑處理?xiàng)l件下分支增多、CMI值有顯著的變化，盡管未見有絲分裂受到明顯的影響。
　　 以上研究結(jié)果表明，同灰葡萄孢菌一樣，多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的作用機(jī)制也是抑制其有絲分裂，但兩者的抗性機(jī)制有差異。
　　 3多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的作用靶標(biāo)
　　 本研究分別敲除禾谷鐮孢菌的β1、β2-微管蛋白基因，并測(cè)定各敲除突變體菌株對(duì)多菌

7、靈的敏感性，結(jié)果表明，敲除其中任意一個(gè)β-微管蛋白基因的突變體菌株都對(duì)多菌靈敏感，但敏感性有差異。同時(shí)獲得綠色熒光蛋白GFP基因與禾谷鐮孢菌的β1、β2-微管蛋白基因的融合突變體菌株，通過熒光顯微觀察多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌β1、β2-微管蛋白的敏感性差異，結(jié)果同樣表明兩β-微管蛋白與多菌靈的敏感性有差異。
　　 以上研究結(jié)果表明禾谷鐮孢菌的β1、β2-微管蛋白都是多菌靈等苯并咪唑殺菌劑的作用靶標(biāo)，但兩β-微管蛋白與多菌靈的敏感性有差

8、異，這種差異可能是由于兩者240位氨基酸的不同而導(dǎo)致的.同時(shí)，研究還表明禾谷鐮孢菌熒光蛋白標(biāo)記的β-微管蛋白基因可以同源替換內(nèi)源的同一β-微管蛋白基因，甚至兩個(gè)內(nèi)源β-微管蛋白基因都可以同時(shí)替換，并能正常表達(dá)，且對(duì)目標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能沒有影響。
　　 4禾谷鐮孢菌兩個(gè)β-微管蛋白基因功能
　　 本研究通過測(cè)定禾谷鐮孢菌β1、β2-微管蛋白基因敲除突變體菌株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特性、生殖生長(zhǎng)能力、細(xì)胞有絲分裂過程及其致病性等方面的生

9、物學(xué)特性，以確定兩個(gè)β-微管蛋白基因功能的差異。研究結(jié)果表明，β1-微管蛋白基因敲除突變體菌株的生物學(xué)表型與野生菌株差異不顯著；而敲除β2-微管蛋白基因的突變體菌株盡管也能完成其生活史，但其菌絲生長(zhǎng)變慢、分支增多、無性及有性生殖能力下降、致病力降低。由此可以看出β2-微管蛋白基因?qū)坦如犳呔潜匦璧亩?-微管蛋白基因是非必需的，但是兩者在功能上是可以相互替代的。同時(shí)用熒光蛋白基因標(biāo)記這兩個(gè)β-微管蛋白基因以測(cè)定其時(shí)空表達(dá)，結(jié)果顯示禾谷

10、鐮孢菌β1、β2-微管蛋白基因在各時(shí)期的菌體細(xì)胞內(nèi)均是同時(shí)表達(dá)的，并都參與微管的組裝。該結(jié)果進(jìn)一步說明兩者在功能上是互補(bǔ)的。
　　 以上研究結(jié)果表明禾谷鐮孢菌β1、β2-微管蛋白基因在各種菌體細(xì)胞內(nèi)均是同時(shí)表達(dá)的，并都參與微管的組裝；兩者在生物學(xué)功能上有些差異，但是在功能上互補(bǔ).
　　 5禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗性的分子機(jī)理
　　 大多數(shù)植物病原真菌苯并咪唑殺菌劑抗性的產(chǎn)生是由于β-微管蛋白基因發(fā)生突變。禾谷鐮孢菌具

11、有兩個(gè)β-微管蛋白基因，前期研究表明其多菌靈抗性菌株β1-微管蛋白基因未發(fā)生突變，而僅β2-微管蛋白基因發(fā)生突變，其突變主要發(fā)生在編碼167、198和200位氨基酸的堿基上.
　　 為了進(jìn)一步證明β2-微管蛋白基因突變與多菌靈抗性的關(guān)系，本研究選取一株禾谷鐮孢菌田間多菌靈高抗菌株，分別敲除其β1、β2-微管蛋白基因，測(cè)定各敲除突變體菌株的多菌靈敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除β2-微管蛋白基因的突變體菌株對(duì)多菌靈超敏感，并且與野生菌株β2-

12、微管蛋白基因敲除突變體菌株對(duì)多菌靈的敏感性一致；而敲除β1-微管蛋白基因的突變體菌株對(duì)多菌靈超高抗。Giemsa染色觀察多菌靈處理這兩類敲除突變體對(duì)其有絲分裂的影響，結(jié)果也證實(shí)了它們對(duì)多菌靈敏感性的變化。應(yīng)用綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記同一田間抗性菌株的β1、β2-微管蛋白，熒光顯微觀察多菌靈的作用，結(jié)果進(jìn)一步直接證實(shí)了該菌株β2-微管蛋白對(duì)多菌靈敏感性的降低。同時(shí)分別用禾谷鐮孢菌多菌靈田間抗性的4種突變方式的β2-微管蛋白基因來恢復(fù)野生菌株