禾谷鐮孢菌β-微管蛋白的原核表達、復性純化和單克隆抗體的制備.pdf

1、小麥赤霉病是我國小麥上最重要的病害之一。目前在植物病害綜合防治體系中，使用苯并咪唑類殺菌劑（如多菌靈）是防治這種病害最常用、最有效的措施。但據(jù)近幾年的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，病原菌對該類殺菌劑的抗性群體發(fā)展迅速。據(jù)本實驗室研究，小麥赤霉病對多菌靈（MBC）的抗性主要是由于禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum.Retch）的β2-微管蛋白基因突變引起的，該蛋白第167位、198位、200位等氨基酸的突變都會引起不同水平的抗性，本文利用原

2、核表達技術構建了β2-微管蛋白不同突變位點基因的表達載體，并制備了野生型菌株β2-微管蛋白的單克隆抗體。為研究其抗性產(chǎn)生的原理和蛋白質(zhì)與藥物的互作奠定了基礎。
　　 本文分別擴增了禾谷鐮孢菌對多菌靈敏感菌株（MBCs）的β1-微管蛋白基因（β1-S）和β2-微管蛋白基因（β2-S），及對多菌靈中抗菌株（MBCMR）和高抗菌株（MBCHR）的β2-微管蛋白基因（β2-MR和β2-HR），測序后構建了原核表達載體β1-S/pET28

3、a，β2-S/pET28a，β2-MR/pET28a，β2-HR/pET28a，轉化至大腸桿菌Rosetta（DE3）pLysS。經(jīng)IPTG（1 mM）誘導后，得到了C末端融合6×His純化標簽的表達產(chǎn)物，產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析和Western blot驗證，表明在大腸桿菌中表達了分子量約50 kD的蛋白，和預測蛋白大小一致，并且表達的蛋白能與抗His標簽的單抗發(fā)生特異性反應。
　　 在原核表達系統(tǒng)，由于構建的表達載體能夠

4、進行高效表達，使得表達的目標蛋白濃度太高而形成包涵體，亦或在原核表達系統(tǒng)中缺少真核表達系統(tǒng)中的修飾體系，而形成包涵體。包涵體蛋白是沒有生物活性的蛋白，必須經(jīng)過溶解、復性和純化才能進一步使用，本文以MBCs菌株β2-微管蛋白（β2-S）為例，優(yōu)化了包涵體洗滌條件，比較了兩種復性方法（直接透析復性和稀釋后透析復性）和三種純化方法（His-TrapHP預裝柱純化法、離子交換純化法、PD-10重力柱純化法），最終選用含3 M尿素的洗滌液進行包涵

5、體的洗滌，用先稀釋后復性的方法進行包涵體復性，用PD-10重力柱純化法純化目標蛋白。
　　 將復性純化后的β2-S作為抗原，常規(guī)免疫小鼠，4周后當小鼠血清效價達到1：6500時進行融合，待觀察到雜交瘤細胞后，以純化的β2-S包被酶標板，進行反復間接EIASA檢測后，得到3株雜交瘤細胞株H1、H2、H3，分別進行單克隆，得到相對應的單克隆細胞株4株（MAb1-1、MAb1-2、MAb2-1、MAb3-1）。用復性純化β2-S的方法