輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioide)孢子表面蛋白提取、基因克隆表達(dá)與功能分析.pdf

1、菌寄生是菌寄生真菌與寄主真菌間的一種寄生方式，是自然界普遍存在的一種真菌與真菌之間的相互作用。輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioide)是一種重要的植物病原真菌和菌寄生中的寄主真菌，菌寄生真菌纖細(xì)齒梗孢(Olpitrichum tenellum)是輪枝鐮孢菌上一種菌寄生真菌，能夠與輪枝鐮孢菌相互識(shí)別，互作并寄生。有證據(jù)顯示，在菌寄生真菌與寄主真菌相互識(shí)別過(guò)程中，寄主真菌孢子表面蛋白具重要作用，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要科學(xué)意

2、義。
　　 疏水蛋白(hydrophpbin)是真菌孢子的一種表面蛋白，它由絲狀真菌特異產(chǎn)生的一類(lèi)分泌型小分子蛋白質(zhì)，存在于真菌菌絲細(xì)胞壁、孢子表面等結(jié)構(gòu)。它含有8個(gè)半胱氨酸殘基和一段分辨性的信號(hào)肽，能夠自組裝成雙親性界面，在真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極為重要生物學(xué)作用。
　　 本文首先采用不同的方法(TCA法、SDS煮沸法、蔗糖滲漲法和凍融法)提取輪枝鐮孢菌孢子表面蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，采用三氟乙酸法獲得

3、了約7條蛋白質(zhì)條帶，其中一條12kDa處蛋白含量較高；采用SDS煮沸法獲得了約4條蛋白質(zhì)條帶且有約2條帶分子量在12kDa處；蔗糖滲漲法和凍融法分別獲得約14條和6條蛋白質(zhì)條帶，前者提取出了大于50kDa的蛋白并且比后者多出一條約25kDa的蛋白。這四種方法獲取蛋白質(zhì)條帶數(shù)量不同，但具有分子量幾乎相同的條帶。通過(guò)比較得知，三氟乙酸法和SDS煮沸法提取的孢子表面蛋白分子量較小，蔗糖滲漲法和凍融法提取的孢子表面蛋白除分子量20kDa以下的蛋

4、白外還能夠提取較大分子量的蛋白。
　　 為了獲得輪枝鐮孢菌疏水蛋白基因，根據(jù)GenBank中注冊(cè)的兩種疏水蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到HydⅠ和HydⅡ兩種疏水蛋白基因cDNA，其中HydⅠ和HydⅡcDNA全長(zhǎng)分別為381bp和372bp，分別包含一個(gè)由127和124個(gè)氨基酸組成的開(kāi)放閱讀框。構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/HydⅠ和pPIC9K/HydⅡ，將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/HydⅠ和pPI

5、C9K/HydⅡ轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得了轉(zhuǎn)酵母工程菌株G-HydⅠ和G-HydⅡ并誘導(dǎo)表達(dá)和純化。純化HydⅠ蛋白得到一條分子量為11.7kDa的條帶，其理論等電點(diǎn)為6.08，純化HydⅡ蛋白得到一條分子量為11.2kDa的條帶，其理論等電點(diǎn)為7.61。純化后的蛋白與輪枝鐮孢菌和纖細(xì)齒梗孢孢子進(jìn)行互作，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白能夠使孢子凝集，HydⅠ使孢子凝集的最適宜pH值為6.0,孢子凝集最多的時(shí)間為15min；HydⅡ使孢子凝集的最適宜

6、pH值為7.0,孢子凝集最多的時(shí)間為10min。
　　 在研究了疏水蛋白孢子對(duì)輪枝鐮孢菌孢子及纖細(xì)齒梗孢孢子的凝聚作用之后，選取了綠色木霉(Trichoderma viride)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)及九州鐮孢菌(Fusarium kyushuense)真菌孢子作為研究對(duì)象，進(jìn)行孢子凝聚實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示疏綿狀嗜熱絲孢菌及九州鐮孢菌孢子與疏水蛋白互作后孢子凝集，而使凝聚的綠色木霉孢子分散