大麗輪枝菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系及FreB基因功能分析.pdf

1、大麗輪枝菌是一種土傳、植物性病原真菌，可以引起多種重要經(jīng)濟(jì)作物的枯萎死亡。一旦植物被感染后，尚無(wú)有效的防治措施。目前，大量的研究工作集中于病原菌毒力及致病關(guān)鍵基因的篩查。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法普遍用于外源基因的轉(zhuǎn)化，但是仍然需要一種更加快捷的轉(zhuǎn)化方法。本研究中，我們獲得了高質(zhì)量的大麗輪枝菌原生質(zhì)體用于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化。利用此體系，獲得了針對(duì)鐵還原酶跨膜元件前體3(FreB，VDAG_06616)基因敲除突變體和回補(bǔ)體。隨后，對(duì)F

2、reB基因在病原菌鐵還原酶活性以及毒力方面的功能進(jìn)行了深入的研究。具體研究結(jié)果如下:
　　1.利用崩潰酶消化并獲得了高質(zhì)量的原生質(zhì)體，在TB3液體培養(yǎng)基中再生效率可達(dá)65％。通過(guò)轉(zhuǎn)化方式（電擊和聚乙二醇）以及外源基因狀態(tài)（線性DNA和質(zhì)粒）對(duì)比發(fā)現(xiàn):在PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，每微克線性GFP表達(dá)盒可得到600個(gè)轉(zhuǎn)化子，每微克GFP質(zhì)粒可得到250個(gè)轉(zhuǎn)化子;電擊遺傳轉(zhuǎn)化中，每微克線性化GFP表達(dá)盒可得到29個(gè)轉(zhuǎn)化子，每微克GFP質(zhì)粒

3、可得到24個(gè)轉(zhuǎn)化子。
　　2.為探索小干擾RNA（siRNA）能否成功導(dǎo)入原生質(zhì)體并發(fā)揮基因沉默作用，針對(duì)上述研究獲得的綠色熒光標(biāo)記大麗輪枝菌(Vd-GFP)中的GFP基因，設(shè)計(jì)4種長(zhǎng)度為19nt、3'端具有兩個(gè)突出堿基的siRNA片段（siRNA-gfp1，siRNA-gfp2，siRNA-gfp3和siRNA-gfp4），利用PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式分別將4種siRNA導(dǎo)入Vd-GFP的原生質(zhì)體中。經(jīng)液體培養(yǎng)后熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn):s

4、iRNA-gfp4沉默效率接近100％，其余siRNA沉默效率較低，約為10％。針對(duì)大麗輪枝菌附著力轉(zhuǎn)錄激活因子Vta2基因設(shè)計(jì)4種siRNA: siRNA-vta1，siRNA-vta2，siRNA-vta3和siRNA-vta4，將4種siRNA單獨(dú)或混合導(dǎo)入到原生質(zhì)體中，根據(jù)菌落直徑測(cè)定和qRT-PCR分析可知:siRNA-vta1具有最高的沉默效率。
　　3.針對(duì)FreB基因，構(gòu)建了敲除質(zhì)粒和回補(bǔ)質(zhì)粒，并通過(guò)PEG介導(dǎo)的原

5、生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得了該基因的缺失突變體(△FreB)和回補(bǔ)體（△FreB-C）。在不同的碳源（淀粉、蔗糖、半乳糖和纖維素）培養(yǎng)基上，△Fre的菌落直徑和產(chǎn)孢量明顯低于野生型和△FreB-C菌株，表明該基因可能與病原菌碳源利用存在密切關(guān)系。分別置于FeSO4、 FeCl3和無(wú)鐵離子培養(yǎng)基上，△FreB的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力明顯受到抑制，尤其是無(wú)鐵離子耐受力下降最為顯著。
　　4.與野生型菌株相比，△FreB鐵還原酶活性下降了大約50％，

6、而此能力在△FreB-C中得到完全恢復(fù)。同時(shí)，△FreB中與鐵代謝途徑相關(guān)的基因(Frect-4，F(xiàn)rect-5，F(xiàn)rect-6和Met)表達(dá)量均顯著上升。通過(guò)平板擴(kuò)散法施加100μM的過(guò)氧化氫時(shí)，△FreB對(duì)氧化脅迫高度敏感。與野生型和△FreB-C相比，△FreB對(duì)過(guò)氧化氫的敏感性高約25％。
　　5.通過(guò)病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)，接種△FreB的煙草表型明顯優(yōu)于接種野生型和△FreB-C的煙草。這表明FreB基因與病原菌毒力緊密相關(guān)。<