PEG介導(dǎo)玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時基因轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用研究.pdf

1、原生質(zhì)體瞬時基因表達(dá)系統(tǒng)以其經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷和高效的獨(dú)特優(yōu)勢，用于研究植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、篩選信號通路途徑中的功能基因以及分析功能基因的特性，已經(jīng)成為一種研究植物生理、生化、分子機(jī)制的重要手段。植物原生質(zhì)體具備與完整植株和組織類似的生理特性，如對植物激素、代謝物、外界環(huán)境、病原誘導(dǎo)的激發(fā)子的刺激能夠做出相應(yīng)的響應(yīng)。結(jié)合遺傳學(xué)，基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因的方法，原生質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用為各種功能基因的高通量篩選和系統(tǒng)特異性分析作出了重要貢獻(xiàn)。目前，擬南

2、芥、煙草和番茄等雙子葉植物的原生質(zhì)體的應(yīng)用已經(jīng)很普遍，尤其是在模式植物擬南芥中，以PEG-Ca2+介導(dǎo)的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)的研究已經(jīng)很成熟。不管是在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和啟動子的研究，還是在功能基因和amiRNA（人工miRNA）的高通量篩選方面都取得很多重要的成果。但是針對玉米和水稻這類單子葉植物的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)的研究還比較少。玉米不僅是一種重要的糧食作物，而且是單子葉植物研究的經(jīng)典模式植物。以電激介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、、啟動子和光合作用中關(guān)鍵酶的研究中都已經(jīng)取得了許多成果。盡管化學(xué)轉(zhuǎn)染方法更易操作，但是以PEG-Ca2+介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法卻很少被報道。由于玉米的轉(zhuǎn)基因工程存在周期長，耗材多，工作量大，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株較困難等問題，這就使玉米在功能基因如轉(zhuǎn)錄因子，啟動子的篩選和功能研究等方面非常困難。而原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)可以快捷，有效地篩選出植物中一些功能基因，并且分析它們的功能特性。因此，玉米原生質(zhì)體瞬時基因轉(zhuǎn)化技術(shù)對玉米功能基因的研究

4、是必不可少的。我們以玉米原生質(zhì)體為材料，詳細(xì)闡述了玉米原生質(zhì)體的提取、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)方法。我們選取玉米的一個基因ZmMYC2-2，采用PEG-Ca2+介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，對ZmMYC2-2進(jìn)行亞細(xì)胞定位，在轉(zhuǎn)錄水平和次生代謝物水平對這個基因的功能進(jìn)行初步分析，并且驗證了玉米原生質(zhì)體也可以篩選amiRNA。經(jīng)研究和分析后得到以下結(jié)論：
　?。?）亞細(xì)胞定位實驗顯示，ZmMYC2-2只在細(xì)胞核中表達(dá)。所以推測ZmMYC2-2基因類似于擬南

5、芥中的AtMYC2基因，可能在玉米的茉莉酸（JA）合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為轉(zhuǎn)錄因子起重要的調(diào)控作用。
　?。?）ZmMYC2-2基因的過表達(dá)實驗結(jié)果表明，與茉莉酸合成有關(guān)的OPR7和OPR8基因都有顯著上調(diào)，與丁布合成有關(guān)的Bx基因也都有顯著上調(diào)，與抗蟲有關(guān)的丁布類次生代謝物的含量與對照相比也都顯著上調(diào)。這些結(jié)果與亞細(xì)胞定位結(jié)果的功能預(yù)測相吻合。
　　（3）ZmMYC2-1和 ZmMYC2-1的人工小RNA（amiRNA）過表達(dá)