限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的玫煙色擬青霉原生質(zhì)轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建.pdf

1、玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)是一種絲孢類昆蟲病原真菌，寄主范圍廣，在害蟲生物防治方面的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力很大。由于所有生防真菌制劑的的有效成份都具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的侵染體，菌種的生態(tài)適應(yīng)性和環(huán)境抗逆性(如耐旱、耐暑、耐紫外輻射、抗殺菌劑、抗除草劑等性狀)在很大程度上決定了菌劑的田間適用性和應(yīng)用效果。因此，殺蟲效果和工藝性狀良好的生產(chǎn)菌株，再通過(guò)遺傳操作和定向選育而獲得一些抗逆性狀，是提高生防真菌制劑技術(shù)水平的基

2、本途徑。本研究旨在構(gòu)建基于限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合(Restrictionenzyme-mediatedintegration，REMI)和原生質(zhì)體的玫煙色擬青霉遺傳操作技術(shù)平臺(tái)，并嘗試將抗草丁膦除草劑的基因?qū)胍恢昃哂猩罎摿Φ拿禑熒珨M青霉基因組中，為生防真菌的遺傳改良和分子育種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：玫煙色擬青霉原生質(zhì)體的制備供試菌株為源自甘薯粉虱(Bemisiatabaci)的玫煙色擬青霉Pfr116菌株，對(duì)粉虱、蚜蟲及葉螨等刺吸式口

3、器害蟲具高毒力。將其分生孢子均勻懸浮于薩氏培養(yǎng)液中，25℃振蕩(120r/min)培養(yǎng)24h后，按10％的比例轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)24h。所獲菌絲經(jīng)0.3％2-巰基乙醇預(yù)處理10min，以0.6mol/LKCl作為原生質(zhì)體制備的滲透壓穩(wěn)定劑，試驗(yàn)了5種不同酶系(2％蝸牛酶、2％裂解酶、0.5％蝸牛酶+1.5％裂解酶、1.5％蝸牛酶+0.5％裂解酶及1％蝸牛酶+0.6％溶菌酶+0.4％纖維素酶)對(duì)菌絲的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果表明，以0.5％蝸牛

4、酶+1.5％裂解酶的混合酶，在28℃下振蕩(90r/min)酶解菌絲2h，菌絲的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率(1.1×106個(gè)/mg菌絲)最高。以0.8mol/L蔗糖作為原生質(zhì)體再生階段的滲透壓穩(wěn)定劑和查氏培養(yǎng)基作為再生基質(zhì)，對(duì)所制備的原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)，獲得了25.7％的再生率。 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及分子鑒定在對(duì)比篩選試驗(yàn)中，Pfr116菌株的原生質(zhì)體對(duì)潮霉素(HygB)不敏感，在0.4mg/mL的濃度下也不能抑制原生質(zhì)體生長(zhǎng)

5、，而0.3mg/mL草丁膦(PPT)對(duì)原生質(zhì)體的抑制效果良好，因此構(gòu)建了帶PPT抗性基因Bar的質(zhì)粒pAn52-1N-Bar進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pAn52-1N-Bar用HindⅢ單酶切線性化，以Cycle-PureKit回收，質(zhì)粒DNA濃度為107.5μg/mL。運(yùn)用HindⅢ介導(dǎo)的REMI技術(shù)，在含0、10、30和50U的4個(gè)內(nèi)切酶單位的50μL反應(yīng)體系中，用線形質(zhì)粒對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再在0.3mg/mL草丁膦的查氏再生平板上

6、培養(yǎng)5d。結(jié)果顯示，10U和30U的內(nèi)切酶單位處理獲得了較高的轉(zhuǎn)化率(12個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA)，50U的內(nèi)切酶單位反而使轉(zhuǎn)化率低于對(duì)照。將所獲轉(zhuǎn)化子在含0.4mg/mLPPT濃度的查氏平板上均能生長(zhǎng)，在25℃下連續(xù)3次轉(zhuǎn)接至不含PPT的24孔板中培養(yǎng)(7d/次)，最后回轉(zhuǎn)至0.4mg/mLPPT的查氏平板上，所有轉(zhuǎn)化子也都能生長(zhǎng)。顯然，轉(zhuǎn)化了獲得對(duì)PPT的穩(wěn)定抗性。 隨機(jī)取8個(gè)轉(zhuǎn)化子，以其基因組DNA為模板進(jìn)行Bar基因的

7、PCR產(chǎn)物檢測(cè)和SouthernBlotting雜交鑒定。結(jié)果表明，Pfr116野生型對(duì)照呈陰性，8個(gè)轉(zhuǎn)化子均呈陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明質(zhì)粒pAn52-1N-Bar已成功插入Pfr116菌株的染色體中，且都以單拷貝的形式插入。 轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)與產(chǎn)孢性狀比較在對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行轉(zhuǎn)接的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兩株突變子2C1和2D6較野生型和其它轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢能力大幅降低。移至新的培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)9d后，2C1和2D6突變體的菌絲生長(zhǎng)明顯較野生型和其它轉(zhuǎn)化子濃密。野生

8、型菌株和2C1、2D6第9天的產(chǎn)孢量分別為1.2×107、1.2×105和8.2×105個(gè)/mm2。顯然，兩個(gè)突變子應(yīng)為產(chǎn)孢缺陷型突變。 綜上所述，由REMI方法構(gòu)建的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系具有低拷貝、高轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種可用于絲孢類生防真菌遺傳操作的有效方法。通過(guò)Pfr116菌株原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得的兩個(gè)產(chǎn)孢缺陷型突變株，可作為產(chǎn)孢相關(guān)功能基因的研究材料。這說(shuō)明本研究所建立的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系將有助于玫煙色擬青霉抗逆性狀及其功