限制性內(nèi)切酶BamHI及具有外切酶活性的phi29DNA聚合酶有滾環(huán)擴增中的應用.pdf

1、核酸作為重要的生物大分子之一，以一種遺傳信息的形式在生物體內(nèi)發(fā)揮各種功能，是從親代向子代傳遞信息的物質(zhì)基礎。核酸的合成、切割、連接、變構(gòu)、修飾等眾多反應在細胞生命進程中無時不在，這對于維持正?；蚪M的復制及修復、實施基因表達的調(diào)控具有重要的意義。許多酶也參與了各種細胞生命進程，這些酶具有獨特的酶活性，比如聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、外切酶等，它們在基礎研究和應用研究中的應用非常廣泛。
　　傳統(tǒng)的酶活性檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳、親和力分

2、析、高效液相色譜以及酶聯(lián)免疫吸附測定。這些方法具有連續(xù)性差、靈敏度低、檢測過程長以及人工參與多等缺點。在本研究中，我們使用以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為原理的方法對限制性核酸內(nèi)切酶進行測定。限制性內(nèi)切酶切割DNA在生命活動中是十分常見的生物學事件。然而核苷酸衍生物對限制性內(nèi)切酶的影響尚不清楚。我們利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法對2'-甲氧基核苷酸和2'-氟代核苷酸對限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BglⅡ的酶切效率的影響進行研究。
　　生命科學的高速發(fā)

3、展需要先進的核酸分析和檢測技術以完成高靈敏度和高特異性的檢測，而傳統(tǒng)的檢測方法往往難以實現(xiàn)。滾環(huán)擴增是新興的一種體外核酸擴增技術。它只需在常溫下進行，操作簡單易行。此外，以G-四鏈體為基本框架的化學發(fā)光可視化檢測也日益受到了人們的關注。
　　在本文，我們首先對滾環(huán)擴增中所用的phi29 DNA聚合酶進行了研究。Phi29DNA聚合酶鏈具有5'-3'聚合酶特性以及3'-5'外切酶校讀功能。我們利用phi29DNA聚合酶的3'-外切酶

4、活性對靶核酸片段上3'末端的非互補序列進行剪切，考察不同長度的非互補序列對滾環(huán)擴增效率的影響，并成功地對含有G2677T/A核苷酸序列進行了SNP檢測。
　　其次，我們利用G-4 DNA和hemin構(gòu)建了DNAzyme檢測體系，利用核苷酸衍生物對環(huán)形模板實施保護，對滾環(huán)擴增的長鏈產(chǎn)物進行了酶切處理，對DNAzyme的形成條件進行了優(yōu)化，實現(xiàn)了可視化檢測。
　　材料與方法:
　　1、圓二色譜分析:
　　利用JASC

5、O-810型圓二色光譜儀(JASCO，Japan)用來測定樣品在溶液中所形成的二級結(jié)構(gòu)特征曲線。
　　2、紫外吸收及熔解曲線分析:
　　利用紫外分析儀（Varian cary300型）檢測修飾與未修飾雙鏈的穩(wěn)定性，測定Tm值等相關參數(shù)，考察修飾后雙鏈的穩(wěn)定性是否對酶切實驗有影響。
　　3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析:
　　利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗(fluorescence resonance energy transf

6、er, FRET)分析甲氧基核苷酸和氟代核苷酸對底物進行修飾后對限制性核酸內(nèi)切酶的影響。并計算了兩個重要的動力學參數(shù)——Vmax和Km。
　　4、DNAzyme方法:
　　G-4 DNA能夠與氯化血紅素結(jié)合形成具有過氧化物酶活性的模擬酶復合物，可催化H2O2氧化2，2-吖嗪雙（3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸）二銨鹽(ABTS)，從而使體系的顏色發(fā)生變化。
　　實驗結(jié)果:
　　1、BamHI的酶濃度與酶切反應初速度之

7、間具有良好的線性關系。2'-甲氧基核苷酸（2'-OMeNA）對BamHI識別序列GGATCC修飾的酶切阻滯效應均具有位點依賴性。2'-甲氧基核苷酸修飾BamHⅠ-T4位點的底物抑制酶切反應，而G1、C5和C6位點修飾的底物可以促進酶切反應。
　　2、BglⅡ的酶濃度與酶切反應初速度之間具有良好的線性關系。2'-甲氧基核苷酸(2'-OMeNA)對BglⅡ識別序列AGATCT修飾的酶切阻滯效應也具有位點依賴性。2'-甲氧基核苷酸修飾B

8、glⅡ-T4位點底物仍可阻滯酶切反應，A1和A3位點修飾的底物可促進酶切反應。
　　3、2'-氟代核苷酸修飾時，BamHI和BglⅡ的各個修飾底物無一例外地阻礙酶切反應，只是阻滯程度不同。
　　4、在滾環(huán)擴增反應中，2'-甲氧基核苷酸修飾BamHI-T4位點可以保護環(huán)形模板，但是BamHI仍然可以剪切在滾環(huán)擴增過程中產(chǎn)生的長鏈DNA成為短鏈，使得剪切產(chǎn)物能夠形成G-四鏈體，為DNAzyme的檢測信號得到實現(xiàn)。
　　5、

9、利用phi29 DNA聚合酶的外切酶活性，可以對靶核酸片段上3'末端的非互補序列進行剪切，對滾環(huán)擴增效率不產(chǎn)生太大的影響。
　　結(jié)論:
　　1、利用2'-甲氧基核苷酸或2'-氟代核苷酸對內(nèi)切酶底物進行修飾，可以使限制性核酸內(nèi)切酶BamHI及Bg/Ⅱ發(fā)生不同的酶切效應。2'-甲氧基核苷酸修飾底物可以調(diào)節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的活性，有助于在合成生物學中用于構(gòu)建新的生物系統(tǒng)。
　　2、在滾環(huán)擴增中，2'-甲氧基核苷酸修