聚合酶-內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng)(PEAR)制備硫代和2‘-氟修飾寡核苷酸及其促凋亡活性的初步研究.pdf

1、人工合成的寡核苷酸（ODNS）廣泛應(yīng)用于基因的診斷和治療。作為一種有效的基因表達(dá)調(diào)節(jié)工具，反義寡核苷酸已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的靶向基因治療藥物。未修飾的天然寡核苷酸容易被內(nèi)源性核酸酶所降解，而且有些還發(fā)現(xiàn)具有嚴(yán)重的副作用。然而帶有合適的化學(xué)修飾基團(tuán)的寡核苷酸，在體內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，副作用小，比相應(yīng)的未修飾的寡核苷酸更具有活力。目前寡核苷酸幾乎都是使用DNA合成儀進(jìn)行化學(xué)合成，大規(guī)模的制備和純化十分困難，不僅設(shè)備成本非常高，而且使用危險(xiǎn)化

2、學(xué)品。在之前的研究中，我們提出了一種用于大量制備反義寡核苷酸的核酸擴(kuò)增技術(shù)—聚合酶-內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng)（Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR）。在本文中的第一部分，我們用PEAR技術(shù)制備了硫代磷酸修飾和2‘-氟修飾的反義寡核苷酸，利用電噴霧液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ESI/LC/MS）對(duì)PEAR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，分析了PEAR產(chǎn)物的各個(gè)組分。分析結(jié)果顯示 PEAR產(chǎn)物的純度高達(dá)1

3、00.0％。PEAR產(chǎn)物的雙鏈可用反向高效液相色譜(RP-HPLC)技術(shù)進(jìn)行拆分和純化，獲得正義鏈和反義鏈。利用PEAR技術(shù)，通過―滑動(dòng)-切割‖的機(jī)制，能夠使用少量的化學(xué)合成的寡核苷酸種子，制備大量的高純度的目標(biāo)寡核苷酸。與化學(xué)合成的方法相比，具有成本低，純度高，易純化，易大量制備等優(yōu)點(diǎn)。證明了PEAR技術(shù)可以作為大量制備修飾的反義寡核苷酸的一種工具。
　　文章的第二部分，我們檢測(cè)了PEAR產(chǎn)物的生物學(xué)活性。一般情況下反義寡核苷酸

4、是以單鏈形式在細(xì)胞中或者體內(nèi)發(fā)揮作用的。PEAR的產(chǎn)物為雙鏈寡核苷酸的重復(fù)序列，使用之前必須將PEAR產(chǎn)物進(jìn)行完全酶切和分離雙鏈。據(jù)報(bào)道，雙鏈寡核苷酸能夠更有效地抑制基因表達(dá)，據(jù)此我們推斷PEAR制備的雙鏈寡核苷酸也應(yīng)該能夠有效地抑制基因表達(dá)。據(jù)報(bào)道，miR-30家族能夠通過抑制p53基因的途徑，來抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的癌變。因此我們把miR-30a作為研究目標(biāo)，利用PEAR技術(shù)制備靶向作用于miR-30a的雙鏈寡核苷酸重復(fù)序列（a

5、nti-miR-30a），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入胃癌細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌細(xì)胞的凋亡率。轉(zhuǎn)染后24h檢測(cè)結(jié)果顯示，未修飾的anti-miR-30a和2‘-氟修飾的anti-miR-30a處理組，細(xì)胞的凋亡率要顯著高于空白對(duì)照組，而且2‘-氟修飾的anti-miR-30a處理組的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效率相對(duì)更明顯。所以我們初步推斷用PEAR技術(shù)制備靶向作用于miR-30a的寡核苷酸重復(fù)序列，能夠抑制胃癌細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)p