限制性內(nèi)切酶DpnⅠ在大腸桿菌W3110菌株中的克隆、表達(dá)純化及其功能研究.pdf

1、基因編輯技術(shù)在基因治療、藥物制備、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)、瀕危動物救助等方面起著非常關(guān)鍵的作用，目前CRISPR/Cas9這一新興編輯技術(shù)基于其高效、方便，快速等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)已經(jīng)被成功運(yùn)用于斑馬魚，擬南芥，釀酒酵母等生物的基因編輯。但是，有關(guān)在大腸桿菌的運(yùn)用不是很成熟，本文首先擬通過該技術(shù)，對大腸桿菌中的相關(guān)基因進(jìn)行快速、高效編輯。
　　該技術(shù)利用一個(gè)二元載體系統(tǒng)：Cas蛋白偶聯(lián)λ-Red重組酶的系統(tǒng)和一個(gè)指導(dǎo)切

2、割的sgRNA偶聯(lián)同源臂donor的載體系統(tǒng)。該技術(shù)操作步驟如下：首先，通過PCR重組技術(shù)原理，獲得需要編輯的目的基因在重組修復(fù)過程中的同源序列；然后將指導(dǎo)切割目的編輯基因20bp序列擴(kuò)增到含sgRNA（cRNA和transcRNA的二元復(fù)合物）的載體上，并將以上同源序列通過PCR重疊的方式構(gòu)建到含20bp的載體上；最后將含λ-Red重組酶的cas9質(zhì)粒系統(tǒng)和含20bp的指導(dǎo)序列又含同源序列的重組載體質(zhì)粒系統(tǒng)同時(shí)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌不同類型的

3、感受態(tài)中，并在含抗生素的平板上篩選，挑取菌落進(jìn)行 PCR鑒定，并將擴(kuò)增的條帶進(jìn)行測序驗(yàn)證，待測序結(jié)果正確之后，消除pcas9質(zhì)粒和含sgRNA的載體質(zhì)粒，最后得到了含缺失基因的大腸桿菌菌株。由于脫氧腺苷酸甲基化酶（Dam）對DNA復(fù)制和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)以及在DNA錯(cuò)配修復(fù)中發(fā)揮很大的作用，首先，嘗試?yán)迷撔滦突蚓庉嫾夹g(shù)構(gòu)建大腸桿菌不同菌株里dam基因的敲除系統(tǒng)，但是很驚奇的發(fā)現(xiàn)缺失dam基因僅能在大腸桿菌W3110和DH5α菌株中被篩選

4、到PCR鑒定陽性菌落，且擴(kuò)增條帶經(jīng)測序得到確定的缺失該部分DNA序列的菌株，而在大腸桿菌BL21DE3中篩選不到陽性；接著為進(jìn)一步驗(yàn)證在大腸桿菌不同菌株中的編輯效率，對大腸桿菌中1,6-二磷酸果糖激酶fbp、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶cysE和二氫硫辛酸脫氫酶IpdA基因進(jìn)行敲除以及將綠色熒光蛋白基因gfp敲入到大腸桿菌基因組中，同樣地，基因的敲除、敲入系統(tǒng)幾乎無法在大腸桿菌BL21DE3工作，但是同樣能在大腸桿菌W3110和DH5α菌株中篩選到

5、陽性。
　　脫氧腺苷酸甲基化酶的作用過程：它首先識別DNA復(fù)制過程產(chǎn)生的未甲基化新生鏈的5'-GATC-3'DNA序列，然后對其中的腺嘌呤進(jìn)行甲基化，最后使得新生鏈與模板鏈一起具有甲基化的修飾特征。而限制性內(nèi)切酶DpnⅠ剛好又是識別5'-GATC-3'序列中甲基化的腺嘌呤并對其進(jìn)行切割，所以就能在缺失dam基因的菌株中表達(dá)得到DpnⅠ蛋白。并且除商業(yè)的 DpnⅠ的運(yùn)用，并沒有關(guān)于該蛋白酶的表達(dá)純化的具體報(bào)導(dǎo)，大量得到DpnⅠ蛋白顯

6、得非常重要。將構(gòu)建好的 pGEX-6p-2-his-DpnⅠ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除dam基因的W3110菌株中，從而獲得該限制性內(nèi)切酶。
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9編輯大腸桿菌不同菌株中基因的敲除系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了在編輯同一基因時(shí)在不同的大腸桿菌菌株中不同的編輯效率，為CRISPR/Cas9技術(shù)在大腸桿菌的運(yùn)用提供了新的認(rèn)識和奠定了一定的理論基礎(chǔ)；并在缺失 dam基因的重組W3110菌株中表達(dá)純化