防御素基因克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、本文主要根據(jù)GenBank已公布的兔防御素NP-1基因和豬防御素pBD-1基因序列，分別選用原核或真核高效表達載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，以期在大腸桿菌或COS-7細胞中得到高效表達，為進一步研究這兩個抗菌肽奠定基礎(chǔ)。本文主要根據(jù)GenBank已公布的兔防御素NP-1基因和豬防御素pBD-1基因序列，分別選用原核或真核高效表達載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，以期在大腸桿菌或COS-7細胞中得到高效表達，為進一步研究這兩個抗菌肽奠定基礎(chǔ)。 在實驗

2、一中，根據(jù)兔防御素NP-1基因序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，應(yīng)用計算機輔助設(shè)計，去除基因原有的影響其在大腸桿菌中高效表達的成分，對原有的NP-1基因序列進行改造，經(jīng)改造后的NP-1基因其編碼的氨基酸多肽鏈一級結(jié)構(gòu)保持不變。采用PCR技術(shù)將兩個片段延伸成一條完整的NP-1基因鏈。將該基因擴增得到的帶酶切位點的產(chǎn)物克隆到pGEM-T easy Vector上，經(jīng)酶切鑒定和序列分析正確后，再經(jīng)雙酶切連接到用同樣酶切的載體pMAL-p2X上，

3、并將得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli TB1，以濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)表達。 在實驗二中，根據(jù)豬防御素pBD-1基因序列，應(yīng)用計算機軟件設(shè)計出一對帶有酶切位點Hind Ⅲ，Xba Ⅰ的引物。從新鮮的豬舌表皮組織細胞中分離提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增出豬防御素pBD-1基因的第一鏈cDNA，將回收的第一鏈cDNA產(chǎn)物用上述特異引物再次擴增、回收，得到約213bp的目的片段，用T4DNA連接酶將