豬β-防御素1基因在大腸桿菌中的表達(dá)與活性鑒定.pdf

1、防御素(defensins)是生物體在抵御病原微生物的防御過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)重要的抗菌肽類(lèi)物質(zhì)。它具有十分廣泛的抗菌譜，可以抵抗細(xì)菌、真菌、被膜病毒等多種微生物。由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，不會(huì)誘發(fā)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，已成為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩?br>　　 豬β防御素-1(porcineβ-defensin1，pBD-1)是廣泛分布于豬消化道、呼吸道、肝和腎等多種組織細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)活性多肽，在豬防御系統(tǒng)中起重要作用。它同樣可被用作食品

2、保鮮劑和飼料添加劑，隨著對(duì)其研究的深入，可以相信豬防御素將在動(dòng)物養(yǎng)殖、疾病預(yù)防和提高畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮更大作用。本研究的目的就是在克隆豬舌上皮防御素的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)pBD-1的高效表達(dá)，通過(guò)蛋白復(fù)性方法，以期獲得高產(chǎn)量有活性的防御素產(chǎn)品，為豬防御素的工程化生產(chǎn)及在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以健康新鮮豬舌上皮黏膜為實(shí)驗(yàn)材料，以GenBank中報(bào)道的pBD-1的cDNA序列及載體pET-30a的多

3、克隆位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，其中上游引物含有BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物含有Xhol酶切位點(diǎn)。采用RT-PCR方法擴(kuò)增出pBD-1基因，將其克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)BamHI和Xhol限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-pBD-1獲得編碼成熟肽pBD-1基因，大小為126 bp，然后插入到pET-30a載體的BamHI和Xhol位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-pBD-1；重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Roseett

4、a(DE3)中，經(jīng)測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建pBD-1的融合表達(dá)系統(tǒng)。陽(yáng)性克隆菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵和IPTG誘導(dǎo)，菌液破碎后進(jìn)行Tricine SDS-PAGE分析，融合蛋白純化，酶切去除His標(biāo)簽，蛋白復(fù)性，最后利用瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性。結(jié)果表明，融合蛋白His-pBD-1以可溶性的形式進(jìn)行表達(dá)，蛋白純化后經(jīng)Bradford法測(cè)定1L菌液可表達(dá)約50 mg的融合蛋白；蛋白復(fù)性后，His-pBD-1和pBD-1蛋白均表現(xiàn)出對(duì)鏈球菌良好的抑菌活性，

5、可見(jiàn)His標(biāo)簽對(duì)pBD-1蛋白的活性沒(méi)有影響，pBD-1對(duì)鏈球菌的最小抑菌濃度為40±5.2μg/ml。這為進(jìn)一步的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、免疫原性檢測(cè)和抗菌制劑的開(kāi)發(fā)等后續(xù)工作奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 以巴馬小豬為對(duì)象建立鏈球菌感染模型，采用定量PCR方法，測(cè)定感染后不同時(shí)間點(diǎn)豬舌上皮黏膜中pBD-1表達(dá)量。結(jié)果表明，染菌后3 h pBD-1的表達(dá)水平顯著提高(p<0.001)，且在6h達(dá)到最高水平，染菌后12 h其表達(dá)水平恢復(fù)正常。鏈