花生酰基載體蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)是一類具有保守的絲氨酸殘基的小分子量的酸性蛋白質(zhì)。在脂肪酸合成過程中，ACP攜帶?；溚瓿煽s合、還原和脫氫等酶促反應(yīng)。它還是不同長度?；湹闹舅岬孽；鵄CP去飽和反應(yīng)和質(zhì)體類酰基轉(zhuǎn)移酶作用的輔助因子。植物貯藏脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量、組成以及它們在總脂肪酸中所占的比例，與ACP異構(gòu)體的種類及差異表達(dá)有密切關(guān)系。 已有研究表明，在擬南芥中表達(dá)由35S啟動子驅(qū)動的帶

2、有其上游400bp調(diào)控區(qū)ACP1基因，引起轉(zhuǎn)基因植株葉組織中ACP1基因的表達(dá)量增加了3—8倍，而在種子中沒有明顯的變化。同時，也使葉組織中脂肪酸組成發(fā)生了變化，16：3的含量明顯減少，而相應(yīng)的增加了亞麻酸18：3的含量，但總脂肪酸含量不變。 本研究在克隆獲得花生AhACP1-1基因和AhACP1—2基因的基礎(chǔ)上，對這兩個基因在根、莖、葉、花和種子表達(dá)模式進(jìn)行了分析；并在擬南芥、煙草和花生中利用過量表達(dá)和反義抑制表達(dá)策略驗證這兩

3、個基因的功能。主要研究結(jié)果如下： 1.用半定量RT—PCR方法分析AhACP1-1和AhACP1—2在根、莖、葉、花和種子中表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)AhACP1-1在莖中幾乎不表達(dá)，在種子的表達(dá)量最高，在根、葉和花中表達(dá)量相近；AhA CP1—2各個部位均有表達(dá)，且表達(dá)量在種子和葉片中較高，在根和花中次之，莖中最弱。 2.以pROKII為原始載體，將AhA CP1-1和AhACP1—2這兩個基因編碼區(qū)及其上游約54 bp和下游約2

4、0 bp正向和反向插入載體的相應(yīng)位點，由此獲得4個植物表達(dá)載體。其中，上游約54 bp包括保守的七核苷酸基序“CTCCGTC”和“CT—rich”區(qū)。 3.擬南芥、煙草和花生的遺傳轉(zhuǎn)化 (1)在擬南芥中過量表達(dá)和抑制表達(dá)花生的AhACP1-1基因和AhACP1—2基因，獲得部分卡那抗性擬南芥，經(jīng)篩選和PCR檢測分別獲得轉(zhuǎn)基因T1代各10株。 (2)在煙草SR1中過量表達(dá)和抑制表達(dá)花生的AhACP1-1基因和AhA

5、CP1—2基因，獲得25株卡那抗性煙草植株，經(jīng)分子檢測均為轉(zhuǎn)基因陽性植株，其中AhACP1-1基因過量表達(dá)和反義抑制各6棵，AhACP1—2基因過量表達(dá)7棵，反義抑制6棵。與野生煙草相比，在絕大多數(shù)獨立的轉(zhuǎn)基因株系中外源基因的表達(dá)量明顯提高。 (3)以魯花14中的胚小葉為外植體，建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系；并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法過量表達(dá)和抑制表達(dá)花生的AhACP1-1基因和AhACP1—2基因，共獲得15株卡那抗性花生植株，PC

6、R檢測結(jié)果均為陽性植株，其中過量表達(dá)獲得5株，反義抑制表達(dá)獲得10株。 4.轉(zhuǎn)基因煙草植株中AhA CPl-1基因和AhACPl—2基因功能驗證 用氣相色譜法檢測部分轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片脂肪酸含量，結(jié)果顯示有兩株轉(zhuǎn)基因植株葉片不飽和脂肪酸含量比野生煙草明顯提高；用分光光度法對經(jīng)過低溫處理的轉(zhuǎn)基因植株葉片中的丙二醛、游離脯氨酸和可溶性糖的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，在低溫脅迫下，與對照煙草相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片中游離脯氨酸和可溶性

7、糖的含量具有不同程度提高，而丙二醛含量則有所降低。 綜上所述，本研究優(yōu)化了花生再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系；通過基因工程手段在不同物種中過量表達(dá)和抑制表達(dá)了花生的AhACP1-1基因和AhACP1—2基因；轉(zhuǎn)基因功能分析表明，在煙草中組成型表達(dá)這兩個基因可以改變轉(zhuǎn)基因植株葉片脂肪酸組成，并且葉片中不飽和脂肪酸含量增加可能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性；下一步我們將在轉(zhuǎn)基因擬南芥和花生中進(jìn)一步分析這兩個基因的功能，并在花生種子中過量表達(dá)這兩個基因，