灰葡萄孢分生孢子產(chǎn)生基因bc1g_12707.1的克隆及功能分析

1、摘要通過(guò)篩選灰葡萄孢A T M T 突變體庫(kù)，獲得一株不能產(chǎn)生分生孢子的突變菌株B C t 7 8 ，采用P C R 和S o u t h e r nB l o t i n g 技術(shù)，對(duì)突變菌株B C t 7 8 進(jìn)行了分子鑒定。利用T A I L ．P C R 技術(shù)獲得T - D N A 插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列；將所獲得側(cè)翼序列與灰葡萄孢基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的己知基因序列進(jìn)行B L A S T 分析，推測(cè)出了T - D N A 的插入基因；通過(guò)

2、P C R 進(jìn)一步驗(yàn)證T - D N A 的插入位點(diǎn)，利用R T - P C R 技術(shù)確定突變基因；最后對(duì)突變菌株的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、胞壁降解酶活力、粗毒素的生物活性、對(duì)番茄葉片的致病能力及部分致病相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究灰葡萄孢分生孢子產(chǎn)生及致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。1 ．T A I L ．P C R 結(jié)果證實(shí)T - D N A 插入到灰葡萄孢B C l G1 2 7 0 7 ．J 『基因的起始密碼子處：R T

3、- P C R 結(jié)果證實(shí)突變基因?yàn)锽 C l G1 2 7 0 7 ．J ，該基因D N A 全長(zhǎng)為1 3 5 b p ，編碼1 個(gè)由4 4 個(gè)氨基酸所組成的假定蛋白( h y p o t h e t i c a l p r o t e i n ) 。2 ．突變菌株在P D A 培養(yǎng)基上菌落呈灰白色、生長(zhǎng)速度減慢、不能產(chǎn)生分生孢子及菌核；對(duì)番茄葉片的致病性增強(qiáng)，且胞壁降解酶P G 、P M G 活性顯著增強(qiáng)。突變菌株中參與細(xì)胞壁降解的角

4、質(zhì)酶基因c u t A 、多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶基因B c p 9 1 ；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因P K A l 、P K A 2 、B a c 、B m p 3 ；產(chǎn)毒素基因B c B O T 2 ( s e s q u i t e r p e n e s y n t h a s e ) 、漆酶基因L a c l ；跨膜蛋白基因B 矽』表達(dá)增強(qiáng)。3 ．B C l G1 2 7 0 7 ．1 基因在灰葡萄菌株的產(chǎn)孢、產(chǎn)菌核及其致病力等方面起到重要

5、的作用。關(guān)鍵詞：灰葡萄孢；分生孢子產(chǎn)生；T - D N A 插入突變體；致病性；C T A Bd d H 2 0E BE D T AP C Rr p mS D Sd N T PT r i sD M FP G T EP M GP GC xP E GP M T E縮寫(xiě)詞表C e t y lT r i m e t h y A m m o n i u m B r o m i d e 十六烷基三甲基溴化銨D o u b l e D i s t i

6、 l l e d W a t e rE t h i d i u mB r o m i d e雙蒸水溴化乙錠E t h y l e n e d i a m i n eT e t r a a c e t i c A c i d 乙二胺四乙酸P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)R e v o l u t i o n s p e r m i n u t e 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)S o

7、d i u m d o d e c i ls u l f a t e 十二烷基硫酸鈉D e o x y n u c l e o t i d e T r i p h o s p h a t e s 脫氧核苷三磷酸T r i s ( H y d r o x y m e t h y l ) A m i n o m e t h a n e 三( 羥甲基) 氨基甲烷N , N ．D i m e t h y lf o r m a m i d e 二

8、甲基甲酰胺P o l y g a l ∞咖n i ca c i dt r a n s ．e l №e 毳聚半乳糖醛舨艄除P e c t i nm e t h y l g a l a c t u i o n a s e 果膠甲基半乳糖醛酸酶P o l y g a l a c - t u c o n a s eC e l l u l a s e多聚半乳糖醛酸酶纖維素酶P o l y e t h y l e n eg l k y c o l