調(diào)控玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的PKC基因的克隆.pdf

1、本論文對玉米大斑病菌PKC基因進(jìn)行了克隆、生物信息學(xué)分析和藥物學(xué)(PKC的特異性抑制劑)分析，初步明確了玉米大斑病菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的PKC基因與分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的關(guān)系；此外，本文還探討了光照、酸堿脅迫、營養(yǎng)脅迫和孢子濃度4種因素對病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響，結(jié)果如下: 1.玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的適宜pH為5.0～7.0，此范圍內(nèi)孢子萌發(fā)率可達(dá)95％，附著胞形成率可達(dá)85％。一定濃度的蔗糖、葡萄糖、

2、D-果糖、玉米葉汁均能促進(jìn)孢子萌發(fā)，最適宜的糖濃度為5％。各種光照處理對病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響差異不大。研究發(fā)現(xiàn)，孢子濃度對病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成影響極大，濃度≤104個(gè)/mL時(shí)，孢子萌發(fā)率及附著胞形成率高達(dá)100％，但高濃度下(≥10 5個(gè)/mL)卻表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，推測真菌在產(chǎn)孢期間孢子萌發(fā)頂端形成了被稱為自身抑制子(self-inhibitor)的小分子量親脂性物質(zhì)所致。 2.根據(jù)已知病原真菌PKC基因核苷酸

3、保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，以玉米大斑病菌菌株01-23基因組DNA為模板，通過PCR技術(shù)獲得PKC基因的同源片段，利用簡并引物逐步延伸方法和染色體步移技術(shù)獲得了PKC基因的DNA全長，共3837個(gè)核苷酸。根據(jù)所得PKC基因的DNA全長序列的5'和3'端序列設(shè)計(jì)特異引物，以病菌cDNA為模板，擴(kuò)增得到PKC基因的全長cDNA序列。通過DNA序列和eDNA序列對比分析后，發(fā)現(xiàn)PKC基因編碼一個(gè)1171個(gè)氨基酸的多肽，DNA序列含有6個(gè)分別為50

4、 bp、62 bp、51 bp、49 bp、52 bp和57 bp的內(nèi)含子，所有內(nèi)含子都符合GT-AG法則。BLASTx分析表明，PKC基因與玉米小斑病菌的蛋白激酶C基因的同源性高達(dá)92％；SignalP預(yù)測結(jié)果顯示玉米大斑病菌PKC的假定蛋白不含有信號肽序列，TMPRED分析推測含有一條長約20個(gè)氨基酸的位于C端的跨膜區(qū)域。Southern雜交表明，PKC基因在病菌基因組中以單拷貝形式存在。 3.InterProScan分析顯

5、示，玉米大斑病菌PKC基因編碼的假定蛋白含有6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為Pkinase_c、S_TKc、ATP位點(diǎn)、C1、C2和HR1。Swissmodel預(yù)測的玉米大斑病菌3D結(jié)構(gòu)與玉米小斑病菌完全一致，與稻瘟病菌PKC基因比較僅一個(gè)α螺旋的差異。利用蛋白激酶C特異性抑制劑白屈菜赤堿(chelerythrine)處理病菌孢懸液，發(fā)現(xiàn)濃度在10μM時(shí)孢子萌發(fā)抑制率達(dá)100％，8μM時(shí)完全抑制了附著胞的形成。此外，抑制劑在孢子萌發(fā)和附著胞形成早