葡萄果形相關基因的克隆及功能分析.pdf

1、葡萄（Vitis vinifera）屬于葡萄科葡萄屬。作為我國重要的落葉果樹之一，在我國大部分地區(qū)都有種植。我國葡萄以鮮食為主，占葡萄總產(chǎn)量的80％以上。隨著人們消費需求的提高，生產(chǎn)者和研究者在保證果品產(chǎn)量增加的同時，轉(zhuǎn)向開發(fā)新、奇、特的高品質(zhì)產(chǎn)品。果實形狀是果實外觀品質(zhì)的重要組成部分，多為數(shù)量性狀，由多基因控制。采用傳統(tǒng)的育種方式進行果形改良，需要相當大的種植規(guī)模以及相當長的篩選時間。從基因和發(fā)育遺傳學層次研究和明確果形的遺傳規(guī)律，實

2、現(xiàn)對果形遺傳的整體控制，將是園藝作物果形研究的重要方向。
　　本研究分別從葡萄品種‘美人指’和‘紅寶石無核’中克隆得到可能與果形相關的基因VvGW2和VvOVATE。對基因進行生物信息學分析，亞細胞定位研究及實時熒光定量PCR分析。VvOVATE轉(zhuǎn)化番茄對該基因的功能進行初步驗證。主要研究結(jié)果如下:
　　1.在NCBI中查找與水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列，通過RT-PCR和RACE技術進行基因克隆，生物信息學進

3、行結(jié)構(gòu)分析，實時熒光定量PCR分析VvG W2基因在‘美人指’不同時期和不同葡萄品種開花期的表達情況。從‘美人指’葡萄中克隆得到一個GW2基因同源序列，命名為VvGW2。該基因開放閱讀框長度為1272bp，共編碼423個氨基酸，具有GW2蛋白保守的RING型結(jié)構(gòu)域，該RING型蛋白為C5HC2類型。推測編碼蛋白相對分子質(zhì)量為46.96KD，理論等電點為4.68。與GenBank中登錄的其他植物GW2蛋白序列相似性為47％-53％。亞細胞

4、定位結(jié)果顯示，VvGW2基因編碼的蛋白定位于細胞質(zhì)中。實時熒光定量RT-PCR分析結(jié)果表明，VvGW2基因在‘美人指’葡萄的各時期均有表達，開花期基因表達量最高。不同品種中，VvGW2基因的表達量存在差異，在指形葡萄品種‘美人指’的表達量最高，在圓形葡萄品種中的表達量很低。推測VvGW2基因在不同時期和不同品種中的表達量上的差異可能與葡萄果實形狀相關。
　　2.在NCBI中查找與番茄果形基因OVATE同源性最高的葡萄序列，通過RT

5、-PCR和RACE技術，從‘紅寶石無核’葡萄中克隆得到一個OVATE基因序列。該基因開放閱讀框長度為1083bp，共編碼360個氨基酸，具有OVATE蛋白保守的OVATE域。與GenBank中登錄的其他植物OVATE蛋白序列相似性為40％-70％。亞細胞定位結(jié)果顯示，VvOVATE基因編碼的蛋白定位于細胞核上。實時熒光定量RT-PCR分析結(jié)果表明，VvOVATE基因在‘紅寶石無核’和‘美人指’各時期均有表達，‘紅寶石無核’葡萄品種在開花

6、后30天表達量最高，而‘美人指’葡萄品種在開花期表達量最高。推測在兩個葡萄品種中，VvOVATE基因表達量和表達時間的差異可能影響葡萄果實的形狀。
　　3.成功構(gòu)建了植物表達載體PBI121-VvOVATE，通過農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化番茄子葉。利用GUS組織化學染色得到了9個株系的陽性植株，提取GUS染色陽性番茄植株的DNA進行PCR檢測，7個株系可以檢測到目的基因片段，說明VvOVATE基因已經(jīng)整合到7個檢測株系的基因組中。

7、對PCR陽性的株系進行RT-PCR擴增，3個株系擴增出目的基因，表明VOVATE在轉(zhuǎn)基因株系中能夠順利轉(zhuǎn)錄，最后獲得3個株系的轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因株系進行表達分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VvOVATE基因在轉(zhuǎn)基因番茄開花期至果實著色期表達量較高，在幼果期表達量達到最高，而在開花前和果實著色后表達量低。表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄營養(yǎng)器官和花器官均發(fā)生變化。表現(xiàn)為:植株矮小，葉片變小且圓，花和果實均變小。這些結(jié)果表明，VvOVATE基因可能抑制植物的生長