生物防治菌株Agrobacterium vitis E26防治葡萄根癌病相關(guān)基因的克隆及功能分析.pdf

1、葡萄根癌病是由葡萄土壤桿菌(Agrobacterium vitis)引起的一種在生產(chǎn)上造成了較大經(jīng)濟(jì)損失的世界性病害。本研究組分離到一株無致病性的葡萄土壤桿菌E26菌株(A．vitis E26)，能有效防治葡萄根癌病，具有良好的應(yīng)用前景。本研究從分子水平研究和分析了E26菌株的生物防治機(jī)制。 通過Tn5隨機(jī)插入，構(gòu)建菌株E26的突變體文庫，以向日葵為指示植物，最終篩選到兩株生物防治能力下降但對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生沒有影響的突變體M82和M

2、27。其中M82仍具備誘導(dǎo)煙草上過敏性反應(yīng)的能力，并且生理生化性狀沒有明顯變化。克隆突變體M82中Tn5插入的基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子破壞的是一個(gè)3.9kb，編碼雜合組氨酸激酶的基因(ahsR)?；パa(bǔ)該基因后，無論在向日葵上還是在葡萄上，都能夠使突變體的生物防治能力得以恢復(fù)。以上結(jié)果說明：1)向日葵可以作為指示植物用以篩選E26突變體；2)除細(xì)菌素外，還有其他因素影響E26菌株的生物防治機(jī)制。3)ahsR編碼的產(chǎn)物很可能是位于信號(hào)傳導(dǎo)的上游。

3、 通過構(gòu)建基因組粘粒文庫，在E26中克隆到一套quorum-sensing調(diào)控系統(tǒng)avsI<,E26>-avsR<,E26>。該調(diào)控系統(tǒng)負(fù)責(zé)合成乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，并且能夠誘導(dǎo)煙草上的過敏性反應(yīng)(Hypersensitive response，HR)。Blast分析發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，AvsI<,E26>和AvsR<,E26>與 A．vitis F2/5中的AvsI<

4、,F2/5>和AvsR <,F2/5>有著最高的同源性，分別是99％和92％。分別缺失avsI<,E26>和 avsR<,E26>后發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)不僅負(fù)責(zé)調(diào)控AHLs的合成，而且與誘導(dǎo)煙草上過敏性反應(yīng)以及葡萄上壞死反應(yīng)能力喪失?；パa(bǔ)這兩個(gè)基因后，可以完全恢復(fù)其功能。研究還發(fā)現(xiàn)avsI<,E26>和avsR<,E26>與細(xì)菌素產(chǎn)生以及其生物防治能力無關(guān)。這些結(jié)果在遺傳學(xué)證明了口avsI<,E26>-avsR<,E26>調(diào)控系統(tǒng)參與誘導(dǎo)了煙草

5、上的過敏性反應(yīng)以及葡萄上壞死反應(yīng)，但與該菌株的產(chǎn)細(xì)菌素能力以及其生物防治能力無相關(guān)性。構(gòu)建啟動(dòng)子融和基因發(fā)現(xiàn)，在E. coli DH5a中AvsR<,E26>在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控avsI<,E26>的表達(dá)，而且AvsR<,E26>并不嚴(yán)格依賴AvsI<,E26>產(chǎn)生的信號(hào)。 研究中發(fā)現(xiàn)，E26菌株中的質(zhì)粒有著復(fù)雜的遺傳背景。通過接合試驗(yàn)證明，突變體M82中Tn5插入在一個(gè)質(zhì)粒上，該質(zhì)?？梢越雍限D(zhuǎn)移進(jìn)入報(bào)告菌株A．tumefacien

6、ce NTL4(pZLR4)。在野生菌株中轉(zhuǎn)入IncP不相容群的載體，菌株固有的在含X-gal平板上顯藍(lán)色的癥狀消失并呈現(xiàn)白色，而且，轉(zhuǎn)入白色菌落檢測(cè)不到quorum-sensing信號(hào)，而且產(chǎn)細(xì)菌素能力也嚴(yán)重減弱。當(dāng)野生菌株轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pDSK519(IncQ)后，會(huì)影響到菌株的生物防治能力。這些現(xiàn)象說明E26菌株攜帶的質(zhì)?？赡芎驮从贗ncP和IncQ的質(zhì)粒不相容，在質(zhì)粒上有控制產(chǎn)細(xì)菌素和調(diào)控quorum-sensing的信號(hào)的因子，而且