葡萄WRKY基因的克隆和功能分析.pdf

1、葡萄在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)遇到病蟲害等生物脅迫以及干旱、低溫、機(jī)械損傷等非生物脅迫，他們會(huì)影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，頻繁使用農(nóng)藥化肥不能從根本上解決問題，只有研究高抗性新品種才是解決植物病蟲害及環(huán)境脅迫的技術(shù)對(duì)策。研究表明，當(dāng)植物受到生物或非生物脅迫后，轉(zhuǎn)錄因子會(huì)結(jié)合到DNA特定位點(diǎn)上，激活或抑制下游基因的表達(dá)，從而在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用。因此，利用植物本身具有的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)進(jìn)行經(jīng)濟(jì)作物的遺傳改良是一條可行的技術(shù)路線。WRKY是植物特有

2、的一類轉(zhuǎn)錄因子，本研究以葡萄為對(duì)象，探索WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與基因表達(dá)調(diào)控反應(yīng)的分子機(jī)制。從葡萄中克隆得到2個(gè)WRKY家族基因，分別對(duì)其做了生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析以及超表達(dá)抗性分析，主要內(nèi)容如下：
　　 1.對(duì)葡萄WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的56個(gè)成員進(jìn)行同源性分析，選出2個(gè)基因Vv WRKY10及Vv WRKY26進(jìn)行克隆，得到了含有完整開放閱讀框和保守WRKY結(jié)構(gòu)域的cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析：
　　 1)

3、.利用生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)站和軟件，對(duì)兩個(gè)蛋白的氨基酸序列組成、信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)等進(jìn)行了分析，分析結(jié)果表明葡萄Vv WRKY10及Vv WRKY26屬于第二類WRKY蛋白，都含有1個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，不具有核定位信號(hào)，并且在絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸處都有磷酸化位點(diǎn)。
　　 2).利用blastp及DNAMAN對(duì)Vv WRKY10、Vv WRKY26蛋白及其他物種的WRKY蛋白進(jìn)行了序列比對(duì)及同源進(jìn)化樹的構(gòu)建，分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白均有

4、不同程度的相似，相似區(qū)域主要集中在保守的WRKY結(jié)構(gòu)域處。
　　 2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，分析了葡萄Vv WRKY10及Vv WRKY26基因在SA、ET及機(jī)械損傷下表達(dá)量的變化，分析表明兩個(gè)基因在脅迫條件下，表達(dá)量均發(fā)生了明顯的變化，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律。
　　 3.構(gòu)建了葡萄Vv WRKY10及Vv WRKY26基因超表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選鑒定后獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株。
　　 上述