新型殺菌劑氰烯菌酯對禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)的作用方式及抗藥性遺傳研究.pdf

1、氰烯菌酯(2一氰基一3一氨基-3-苯基丙烯酸乙酯，試驗號：JS399-19)是由國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心江蘇基地最新合成的一種對鐮孢菌具有較高活性的化合物，特別是對禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）菌絲生長具有強烈的抑制活性，顯示了該化合物具有防治麥類赤霉病的應用前景。在新型殺菌劑進入市場之前研究其作用方式及抗藥性遺傳，對科學制定該殺菌劑的開發(fā)和應用策略具有重要意義。
　　 離體條件下，采用菌絲生長測定法測定該藥

2、劑對禾谷鐮孢菌抗性菌株和敏感菌株的生長抑制活性；同時采用孢子萌芽測定法測定了其對禾谷鐮孢菌分生孢子萌芽的影響。結(jié)果表明，氰烯菌酯能夠強烈地抑制禾谷鐮孢菌敏感菌株菌絲的生長，EC50值分布在0.092～0.141μg/mL之間；并可降低敏感菌株分生孢子的萌發(fā)速率，以及影響其萌發(fā)的方式，使芽管從分生孢子基部和中間細胞萌發(fā)的比率增加；同時氰烯菌酯使敏感菌株分生孢子膨大畸形，并使其芽管腫脹、扭曲，明顯抑制其芽管的伸長生長，但對抗性菌株的抑制作用

3、和致畸作用不明顯。氰烯菌酯對禾谷鐮孢菌菌體呼吸的抑制作用較弱，同時也幾乎不影響菌體丙酮酸的合成量，說明該藥劑很可能不直接作用于禾谷鐮孢菌的呼吸代謝。
　　 將3個抗氰烯菌酯的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum Schw.）菌株分別在含氯酸鹽的MMC培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共獲得了50個硝酸鹽利用缺陷突變體(nit)。比較了抗性菌株的nit突變體與親本在無性和有性階段的主要生物學性狀?？剐跃甑膎it突變體與親本在菌落生長

4、速率、培養(yǎng)性狀和致病性方面沒有顯著差異；但某些突變體中，產(chǎn)孢量和產(chǎn)子囊殼能力方面存在一定差異。此外，禾谷鐮孢菌對氯酸鹽和氰烯菌酯之間沒有交互抗藥性，且抗性可以穩(wěn)定遺傳。因此，可以將nit作為遺傳標記來研究禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性遺傳學。
　　 離體條件下，通過紫外光誘變和藥劑馴化從5個野生敏感的親本菌株中共獲得了86個對氰烯菌酯的抗性菌株，紫外光誘變產(chǎn)生抗性的頻率在1.25×10-7-2.29×10-7之間，而通過藥劑馴化產(chǎn)

5、生抗性的頻率在2.5-6.0％之間，說明發(fā)生抗性的頻率偏高，且大部分抗性菌株都屬于中等抗性水平(MR)或高等抗性水平(HR)。雖然禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯發(fā)生抗藥性以后，不會改變其營養(yǎng)親和能力，但是抗藥性基因不能通過菌絲融合傳遞給另一個菌株或發(fā)生的概率極低，這將不利于對氰烯菌酯的抗性群體的發(fā)展。因此，菌絲融合在禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性群體發(fā)展中的作用較小，
　　 選擇了43個單孢分離的田間野生敏感菌株和45個實驗室誘導的對氰烯菌

6、酯的抗性菌株，測定這些菌株對氰烯菌酯的敏感性，將其劃分為敏感(S)、中抗(MR)和高抗(HR)3個水平（根據(jù)其對氰烯菌酯的敏感性）。所選的3個禾谷鐮孢菌(2043，Y2021B和YNT,分別代表S,MR和HR)對氰烯菌酯的敏感性在自交和無性繁殖過程中可以穩(wěn)定遺傳。從這些菌株中，隨機選取8個代表這三個敏感性水平的菌株用于抗藥性的遺傳研究（F1代法）。并以硝酸鹽營養(yǎng)缺陷型突變體（nit）作為遺傳標記，來確認來自雜交的單個子囊殼。按照S×S、

7、S×HR、MR×HR、HR×HR、MR×S等共設計了6個雜交組合，對各雜交后代對氰烯菌酯的敏感性測定發(fā)現(xiàn)，S×HR、MR×HR和MR×S的雜交后代出現(xiàn)了1:1的分離比例。在雜交組合S×S和HR×HR的后代中均未出現(xiàn)除雙親表現(xiàn)型以外的重組性個體（即未出現(xiàn)抗性水平的分離）。因此，筆者認為，禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性是由單個基因控制的，該基因的不同突變類型很可能導致不同水平的抗藥性（MR和HR），抗藥性不受修飾基因或細胞質(zhì)遺傳因子的影響。<

8、br>　　 以硝酸鹽營養(yǎng)缺陷型突變體(nit)和多菌靈抗性為遺傳標記，在6個所選菌株中設計了3個禾谷鐮孢菌(Furarium graminearum)的室內(nèi)雜交組合和三個田間雜交組合，使各菌株之間進行雜交，從而研究有性重組。在每個田間雜交組合的稻樁表面隨機挑取100個以上雜交或自交的單個子囊殼，檢測結(jié)果表明三個雜交組合的雜交頻率為5.7-20.9％，從而確認了在田間條件下發(fā)生了有性重組。從各雜交組合的后代中任意挑選出3個有性重組體，比

9、較了這些有性重組體與其親本在無性和有性階段的主要生物學性狀。結(jié)果表明，禾谷鐮孢菌中的nit基因及對殺菌劑多菌靈的抗藥性基因可以通過有性雜交的方式重組，即發(fā)生了有性重組。有性重組體與其親本在菌落生長、培養(yǎng)性狀和致病性方面沒有顯著差異；但某些有性重組體中，產(chǎn)孢量和產(chǎn)子囊殼能力方面存在一定差異?？傮w看來，有性重組體仍然保持了較高的適合度。因此，可以認為有性重組在禾谷鐮孢菌群體對多菌靈抗藥性發(fā)生發(fā)展以及群體遺傳進化中可能起著重要的作用。

10、　　 為了評估田間對多菌靈已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯產(chǎn)生抗性的風險，選擇了5個菌株（對多菌靈抗性或敏感），并被鑒定為對多菌靈敏感(S)、中抗(MR)和高抗(HR)，并用來在含10μ,g/mL氰烯菌酯的PSA培養(yǎng)基平板上誘導對氰烯菌酯的抗藥性.總共獲得了24個對氰烯菌酯抗性的突變體這些抗藥性突變體能在PSA培養(yǎng)基平板上轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8次后和在4℃冰箱里保存60天后仍然保持著對氰烯菌酯和（/或）多菌靈的抗藥性?？梢酝茰y，對多菌靈的抗藥

11、性和對氰烯菌酯的抗藥性在兩個親和菌株的菌絲融合過程中不能發(fā)生抗藥性物質(zhì)的交換，這可能會在一定程度上能夠延緩田間菌株對氰烯菌酯產(chǎn)生抗藥性。在某些抗藥性突變體中，菌絲生長和產(chǎn)孢能力出現(xiàn)下降，說明禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯產(chǎn)生抗藥性突變也可能導致適合度的降低。然而，大多數(shù)突變體都顯示了與其親本相似的有性繁殖能力和致病性。而且，總體看來，大多數(shù)突變體都擁有著與親本相似的適合度。多菌靈和氰烯菌酯的防效試驗與室內(nèi)活性測定的結(jié)果一致。氰烯菌酯對田間抗多菌靈