刺糖多孢菌基因工程菌構(gòu)建及多殺菌素生物合成研究.pdf

1、多殺菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物,屬新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。多殺菌素被認(rèn)為是繼阿維菌素之后最為有效的生物殺蟲劑,成為新型生物農(nóng)藥研發(fā)的熱點(diǎn)。然而,由于其發(fā)酵單位低、副產(chǎn)物多、產(chǎn)品收率低,導(dǎo)致生產(chǎn)成本高,制約了其工業(yè)化生產(chǎn)和全面推廣應(yīng)用。因此,本研究通過代謝工程的方法對多殺菌素的合成途徑進(jìn)行了改造,此外,還對多殺菌素合成過程中的一些關(guān)鍵問題作了研究

2、。主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究成功的建立了適合特定大小質(zhì)粒的刺糖多孢菌的基因操作系統(tǒng)。本研究通過已建立的刺糖多孢菌操作系統(tǒng),成功的利用一種理性設(shè)計(jì)的手段,對多殺菌素合成途徑進(jìn)行了改造。首先,為了使帶有鼠李糖糖苷配基的大環(huán)(R-AGL)更多的朝著PSA合成的方向進(jìn)行,基因spnK在刺糖多孢菌中被過表達(dá)了。然后為了解決福樂糖胺合成量不夠的問題,參與福樂糖胺合成的六個基因(spnP,spnO,spnN,spnQ,spnR和spnS

3、)和spnK被共同表達(dá),在這株基因工程菌中,使得積累的PSA轉(zhuǎn)化成了多殺菌素。為進(jìn)一步提高多殺菌素的產(chǎn)量在基因工程菌LU104中過表達(dá)了gtt,gdh,kre,spnP,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS和spnK基因后,多殺菌素的產(chǎn)量達(dá)到了405mg/L,產(chǎn)量較野生菌株提高了5倍。
　　2.在本工作中,選擇了8個可能的參照基因(16SrRNA,GAPDH,tufA,hprT,rbL13,rpoB,ubQ和hrdB)

4、。用三個標(biāo)準(zhǔn)化算法(BestKeeper,geNorm和Normfinder)對這8個備選參照基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示在不同刺糖多胞菌株和不同培養(yǎng)條件下,16SrRNA和rbL13的表達(dá)量均穩(wěn)定,為最佳參照基因。而在鏈霉菌中常用的GAPDH和rpoB基因則不適合作為刺糖多胞菌中RT-qPCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的參照基因。
　　3.本研究在基因水平和代謝物水平從脂肪酸β氧化,脂肪酸從頭合成和多殺菌素合成的角度,解釋外源脂肪酸的添加可以提高