生物合成對(duì)羥基苯甲酸的釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、對(duì)羥基苯甲酸作為合成對(duì)羥基苯甲酸酯類的重要前體，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式為利用石油中有效成分進(jìn)行合成，對(duì)環(huán)境污染較大，因此，近年來眾多科研工作者投入到對(duì)羥基苯甲酸的生物合成中。本研究以釀酒酵母為宿主，在釀酒酵母中構(gòu)建對(duì)羥基苯甲酸的生產(chǎn)途徑，并通過提升相關(guān)途徑通量，實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的逐步提高。
　　1.在釀酒酵母中構(gòu)建對(duì)羥基苯甲酸的合成途徑。引入大腸桿菌及惡臭假單胞菌來源的ubiC基因，構(gòu)建分支酸到對(duì)羥基苯甲酸的生產(chǎn)

2、途徑，通過比較不同來源基因，確定在釀酒酵母中，大腸桿菌來源的ubiC基因表達(dá)效果更好，并比較了不同啟動(dòng)子對(duì)ubiC基因的表達(dá)效果，最高產(chǎn)量達(dá)到11.34±0.13mg·L-1。
　　2.對(duì)釀酒酵母中莽草酸途徑進(jìn)行改造。通過構(gòu)建質(zhì)粒181-TEF2p-Aro4-CYCLt-TEF1p-ubiC-CYCLt，過表達(dá)Aro4基因，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，解除反饋抑制作用，并通過更換啟動(dòng)子增加實(shí)驗(yàn)平行性，使產(chǎn)量達(dá)到了32.09±0.77mg

3、·L-1。在此基礎(chǔ)上，在釀酒酵母基因組上整合大腸桿菌來源莽草酸途徑基因、提升釀酒酵母自身莽草酸途徑基因Aro1的表達(dá)量，并通過過表達(dá)編碼分支酸合酶Aro2基因，對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量達(dá)到了35.22±1.74mg·L-1。
　　3.對(duì)釀酒酵母中磷酸戊糖途徑進(jìn)行改造。在基因組上替換ZWF1基因啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1p。同時(shí)，針對(duì)磷酸戊糖途徑基因TKL1、RKI1進(jìn)行過表達(dá)，使產(chǎn)量提升了6.96％。最后對(duì)磷酸戊糖途徑負(fù)調(diào)控因子RIC1基因