野桑蠶不同組織細胞色素P450 CYP305B1V1基因的誘導(dǎo)表達特征研究及其啟動子活性分析.pdf

1、細胞色素P450酶系是一類普遍存在于脊椎動物或無脊椎動物(包括昆蟲)、植物和微生物中的代謝酶系。在生命過程中，內(nèi)源物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化或外源化合物的活化與降解等都需要細胞色素P450酶系的催化與調(diào)控。野桑蠶(Bombyxmandarina Moore)是一種主要的鱗翅目害蟲，嚴(yán)重影響桑樹生長和蠶業(yè)發(fā)展，同時，它與家蠶有非常近的親緣關(guān)系。為深入了解野桑蠶細胞色素P450的結(jié)構(gòu)和功能，我們就野桑蠶不同組織細胞色素P450 CYP305B1V1基

2、因的誘導(dǎo)表達特征及其啟動子活性開展了研究，主要研究結(jié)果如下： 用不同濃度梯度的NaF、蕓香苷、氯氰菊酯溶液浸泡過的桑葉添食家蠶和野桑蠶，研究不同藥物對野桑蠶和家蠶主要生理特征的影響。48 h后，各個試驗組中，家蠶和野桑蠶的死亡率分別為：10-4 mol/L NaF(66.7％，13.3％)；5×10-3ng/μL蕓香苷(60％，26.7％)；0.1 ng/μL氯氰菊酯(46.7％，11.3％)。家蠶的死亡率明顯高于野桑蠶，表明在

3、供試濃度范圍內(nèi)，野桑蠶對NaF、蕓香苷和氯氰菊酯的耐受性明顯強于家蠶。 以上述四種藥物添食后存活的野桑蠶為材料，參照GenBank中公布的野桑蠶CYP305B1V1基因的mRNA序列，設(shè)計1對引物，采用半定量RT-PCR方法分析經(jīng)NaF、蕓香苷、氯氰菊酯和蛻皮激素處理的野桑蠶各組織中CYP30581V1基因的表達情況，并對該基因的氨基酸序列進行同源比較和進化分析。結(jié)果顯示，氯氰菊酯、蕓香苷和NaF對于野桑蠶CYP305B1V1基

4、因在組織中的表達是有影響的，而蛻皮激素?zé)o明顯影響。氨基酸的同源性分析表明該基因氨基酸序列與家蠶CYP305B1的氨基酸序列同源性最高，為100％；與赤擬谷盜可能的CYP305 A1、蜜蜂可能的CYP305A1、果蠅CYP305A1、岡比亞按蚊CYP305A2及庫蚊CYP2L1之間有較高的同源性。 用PCR方法從野桑蠶基因組DNA中擴增了細胞色素P450 CYP305B1V1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1000和1500 bp左右的2段序

5、列，構(gòu)建由其驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶基因報告質(zhì)粒pGL-YTA和pGL-YTB，和內(nèi)參載體pRL-TK一同在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9細胞，通過用NaF、蕓香苷、蛻皮激素以及氯氰菊酯的誘導(dǎo)，體外分析該基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性及與調(diào)控相關(guān)的因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGL-YTA和pGL-YTB兩個報告質(zhì)粒的熒光素酶相對活性分別是基本載體pGL3-Basic載體的5.2倍和2.1倍，說明這兩段序列都具有啟動子活性，且在轉(zhuǎn)錄起始位點上游1000-1500bp之間

6、的序列可能具有與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的元件。四種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)結(jié)果表明，對于pGL-YTA，10-2mol/L的NaF可以使該啟動子在誘導(dǎo)前后相對活性增加1.8倍；對于pGL-YTB，10-2mol/L的NaF和0.05ng/μl的氯氰菊酯分別可以時該啟動子在誘導(dǎo)前后相對活性增加2.25倍和5.39倍。 基因誘導(dǎo)表達和啟動子活性分析綜合表明，CYP305B1V1基因在野桑蠶體內(nèi)可能主要參與外源性的有毒物質(zhì)的代謝過程，其具體作用機制還待進一步