家蠶細胞色素P450基因及其定量方法的研究.pdf

1、細胞色素P450酶系又稱作多功能氧化酶(MFO)，是廣泛存在于所有需氧生物中的一類代謝酶系，細胞色素P450基因起源于35億年前的一個共同祖先，是最古老和最龐大的超基因家族之一，在生命的過程中，它對內(nèi)源物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化或外源化合物的活化與降解等進行催化和調(diào)控。在昆蟲基因組中大約有100個左右的P450s，它們的作用涉及生長、發(fā)育、取食等過程，其對異生物質(zhì)的代謝特性導(dǎo)致了昆蟲對殺蟲劑的抗藥性和對植物有毒物質(zhì)的耐受性，它還參與了昆蟲體內(nèi)保幼

2、激素、蛻皮激素和脂肪酸等內(nèi)源化合物的合成與代謝。 家蠶(Bombyx mori)是鱗翅目昆蟲的模式生物，本研究以家蠶為研究對象，對家蠶P450基因CYP305B1基因組序列進行了分析；通過對目前家蠶實時定量PCR研究中常用的內(nèi)源參照基因進行分析，提出了新的定量PCR方法，并應(yīng)用此方法，對家蠶和野蠶(Bombyx mandarina)部分P450基因進行了定量研究。本論文的主要研究結(jié)果如下： 1.家蠶P450基因CYP30

3、5B1的克隆及其結(jié)構(gòu)分析 為了研究家蠶P450基因CYP305B1的結(jié)構(gòu)，采用了反向PCR(inverse PCR)技術(shù)，克隆了家蠶CYP305B1基因的基因組DNA，經(jīng)序列測定，拼接得到家蠶CYP305B1全基因序列，并與野桑蠶P450基因CYP305B1進行了比較分析。結(jié)果表明，CYP305B1和CYP305B1V1在5’UTR上游-400至-770之間370 bp的序列同源性只有40.4％；在第1內(nèi)含子中，與家蠶相比，野桑

4、蠶在翻譯起始密碼ATG上游-340之前多了330 bp的插入序列，而在-110至-340 bp間兩者同源性也只有46.9％。這些結(jié)果為深入研究該基因的功能提供了信息。 2.實時定量PCR方法的比較研究 為了比較目前常用的內(nèi)源參照基因actin-3、GAPDH、28s rRNA，在實驗樣品中加入IFP2基因的mRNA和DNA混合物，作為跟蹤標(biāo)定基因，測定了家蠶各組織中的actin-3、GAPDH、28s rRNA基因的轉(zhuǎn)錄

5、水平。同時測定了后部絲腺中的FibH、FibL基因，中部絲腺Ser-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，并對兩種歸一化方法進行了比較。 結(jié)果表明，actin-3、GAPDH、28s rRNA在家蠶各組織中的差異極大，A3基因在后部絲腺中轉(zhuǎn)錄水平最高(1，098)，中腸最低(9.9)；GAPDH基因的轉(zhuǎn)錄水平以脂肪體最高(10,475)，中腸最低(6.57)。28S rRNA基因的轉(zhuǎn)錄水平以脂肪體最高(97，321)，中腸最低(2，178)。

6、 如用與actin-3、GAPDH、28s rRNA相比的相對表達結(jié)果，則后部絲腺中的FibH，F(xiàn)ibL基因，中部絲腺Ser-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，相互之間差距較大。而應(yīng)用加入IFP2基因的mRNA和DNA混合物作為跟蹤標(biāo)定基因測到的是實際轉(zhuǎn)錄水平，基因FibL和FibH在后部絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平分別為106,453和192,029，Ser-1基因在中部絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平為196,539。把同時加入mRNA和DNA混合物，作為跟蹤標(biāo)定基因的測定

7、方法，稱為雙跟蹤標(biāo)定定量PCR，所得結(jié)果稱為基因的表觀轉(zhuǎn)錄活性。 3.殺蟲劑誘導(dǎo)的P450基因的表觀轉(zhuǎn)錄活性 應(yīng)用雙跟蹤標(biāo)定定量PCR方法，測定了野蠶和不同品種家蠶P450基因的表觀轉(zhuǎn)錄活性。同時，測定了在殺蟲劑敵敵畏和溴氰菊酯誘導(dǎo)下，家蠶L11和野蠶不同P450基因的表觀轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果表明，家蠶品種菁松中P450基因主要在中腸中有較高的轉(zhuǎn)錄，其次是脂肪體；家蠶品種皓月P450基因在絲腺中有較高轉(zhuǎn)錄；野桑蠶的P

8、450基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平，以絲腺最高，其次是中腸。 在敵敵畏和溴氰菊酯誘導(dǎo)下，L11中腸的P450基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)最顯著，其次是脂肪體。L11的P450基因以CYP9A19、CYP9A22顯著上調(diào)。野桑蠶在溴氰菊酯誘導(dǎo)下，CYP9A19、CYP9A22均有顯著上調(diào)，且達到較高轉(zhuǎn)錄活性，而在敵敵畏誘導(dǎo)下野桑蠶被測P450基因未檢測到較高的轉(zhuǎn)錄水平。 4.氟化物誘導(dǎo)下家蠶P450基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平 應(yīng)用雙跟蹤標(biāo)定定

9、量PCR方法，測定了家蠶在NaF誘導(dǎo)下的P450基因的表觀轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果表明，cYPgA19，CYP9A22在中腸中具有較高表觀轉(zhuǎn)錄活性，而CYP305B1，CYP4M5則在脂肪體中有較高表觀轉(zhuǎn)錄活性。 實驗表明，NaF誘導(dǎo)下的時間曲線有組織特異性，把中腸、脂肪體的誘導(dǎo)稱為正向誘導(dǎo)，這反映了家蠶對NaF的抵抗作用，把馬氏管中的誘導(dǎo)稱為反向誘導(dǎo)，這反映了NaF對家蠶的毒害作用。并由此提出了在今后家蠶抗性研究中應(yīng)綜合考慮這兩方面因素