細胞色素P450酶活性分析及抑制機理研究.pdf

1、肝臟細胞色素P450酶系(CYPs)負責人體90％以上的藥物代謝。因此,運用體外代謝反應體系(如肝微粒體)獲取肝藥酶動力學參數(shù)以預測或外推藥物在體內的生物轉化行為,已成為當前新藥研發(fā)中的一項重要內容。尤為關注的是CYP的機理性滅活(即自殺性抑制)或聯(lián)合用藥時多個共存組分對代謝酶清除能力的相互抑制所導致藥物不良反應的風險日趨增大。如何準確、快速地測定和表征藥酶催化活性的動力學參數(shù)和抑制機理,對候選化合物的類藥性篩選、體內清除和藥物間相互作

2、用的評估十分重要。然而,目前大多數(shù)的CYP酶活分析方法都基于特征代謝產(chǎn)物的生成速率,并局限于單組分體系或簡單抑制作用的測試與評價。傳統(tǒng)方法不僅要求預先獲得代謝產(chǎn)物標準品和較高的檢測靈敏度,也不適合多組分或復雜藥物相互作用體系的快速篩選。
　　 針對現(xiàn)有CYP酶活分析方法的局限性,本文對底物消除法測定酶動力學參數(shù)的實用性進行了系統(tǒng)驗證；建立了快速篩選中藥復雜體系對人肝CYPs多酶體系抑制潛性的新方法；通過測定機理性抑制劑滅活參數(shù)推

3、測了滅活作用的抑制機理。
　　 論文主要工作如下:
　　 1.基于高效液相色譜技術,以CYP的特異性底物非那西丁(CYP1A2)和右美沙芬(CYP2D6)為探針,比較底物消耗法和傳統(tǒng)產(chǎn)物生成法測定肝微粒體酶催化動力學參數(shù)值的差異,評價底物消除法測定微粒體酶藥物代謝動力學參數(shù)的可行性；并進一步探究了產(chǎn)生差異的因為,為合理使用底物消除法提供依據(jù)。
　　 2.基于流動注射-質譜(FI-MS)直接檢測技術,綜合運用微孔板

4、溫孵、低溫樣品相分離、“6合1”進樣、多探針同時定量分析手段,建立了一種適用于復雜中草藥對人體主要P450酶(5種同工酶6個探針反應)活性的抑制潛性進行快速篩選與分類的新方法。進一步發(fā)現(xiàn)僅用兩抑制劑濃度點測得的IC50值與通常七濃度梯度獲得的IC50值相近,兩點IC50測試的重現(xiàn)性良好。結合兩點IC50測試程序減少樣品數(shù)量,FI-MS/MS方法成功用于10種中藥材粗提液對5種P450酶抑制效應的快速篩選與分類。
　　 3.基于高