褐飛虱細胞色素P450兩個新基因CYP4C61和CYP6CW1的克隆及表達研究.pdf

1、水稻是主要的糧食作物之一,而褐飛虱(Nilaparvata lugens St(a)l.)卻是水稻的頭號害蟲,取食引起的物理傷害及形成的唾液鞘會影響水稻韌皮部的傳導功能,進而擾亂根系的生理活動,并加速葉片衰老。其發(fā)生與危害嚴重影響稻谷的產量。褐飛虱的遷飛習性增加了監(jiān)測與控制褐飛虱發(fā)生的難度,使得褐飛虱給水稻生產造成巨大損失的現(xiàn)象時有發(fā)生。雖然目前科學家已成功培育出各種抗性水稻新品種,但褐飛虱能很快適應水稻新品種,往往導致抗性水稻品種的推

2、廣和應用受到制約。昆蟲的CYP4家族的P450常被報道代謝內源性物質如激素和脂肪酸等,而CYP6家族的P450受植物次生物質和殺蟲劑的誘導,并參與相應底物的代謝。為深入研究褐飛虱細胞色素P450的功能,我們開展了有關褐飛虱細胞色素P450的克隆及表達的研究工作,現(xiàn)總結如下:
　　 采用簡并RT-PCR技術與RACE技術相結合,克隆了褐飛虱細胞色素P450基因CYP4C61和CYP6CW1 cDNA全長。CYP4C61基因的cDN

3、A全長為2581 bp,含有一個編碼503個氨基酸殘基的開放閱讀框(open reading frame,ORF)。在cDNA全長序列的3'端有31個脫氧腺苷酸組成的polyA尾巴,在polyA的上游有1個加尾信號序列AATAAA;該cDNA的5'端非翻譯區(qū)(5'untranslational region,5'UTR)長度為184bp,3'UTR長度為888 bp。該cDNA編碼的蛋白質序列被命名為CYP4C61,該cDNA全長序列已

4、被登錄到EMBL數(shù)據(jù)庫(GenBank accession number:FM163384);CYP6CW1基因全長為2063bp,含有一個編碼539個氨基酸殘基的開放閱讀框ORF。在cDNA全長序列的3'端有30個脫氧腺苷酸組成的polyA尾巴,在polyA的上游有1個加尾信號序列AATAAA;該cDNA的5'端非翻譯區(qū)5'UTR長度為199 bp,3'UTR長度為109 bp。該cDNA編碼的蛋白質序列被命名為CYP6CW1,該cD

5、NA已被登錄到EMBL數(shù)據(jù)庫(FN421126)。對CYP4C61和CYP6CW1的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),它們都含有昆蟲P450基因的保守特征序列,如螺旋K(E-R-P),氧結合結構域即螺旋I(AG-T),血紅素結合區(qū)(PF-G-C-G-F)等。CYP4C61和CYP6CW1氨基酸殘基內部都具有潛在的磷酸化位點,這些位點的磷酸化可能對該酶行使正常功能所必需;另外CYP4C61和CYP6CW1的N端都存在跨膜螺旋,長度分別為25 aa和21

6、 aa。這些特點與P450的降解和代謝功能是密切相關的。
　　 通過GenBank中同源性查找表明,CYP4C61與褐飛虱的另一個P450 CYP4C62的同源性最高,達55％;其次與蜚蠊Blaberus discoidalis的CYP4C1(登錄號P29981)的同源性較高,達54％。CYP4C61,CYP4C62,CYP4C1,CYP4C3和CYP4C39在進化樹中形成一個獨立的簇。CYP6CW1與CYP6BK17的同源性最

7、高,達36％;其次與CYP6CE2的同源性達35％。CYP6CW1,CYP6AX1,CYP6AY1和CYP6BK17在進化樹中形成一個獨立的進化枝。
　　 通過體外轉錄獲得CYP4C61和CYP6CW1的正反義鏈RNA探針,對褐飛虱腸道組織進行整體原位雜交檢測。結果顯示CYP4C61在整個中腸組織不表達。而CYP6CW1在取食感蟲水稻臺中1號(TN1)的褐飛虱腸道組織有本底水平的表達,而在取食中度抗蟲水稻的褐飛虱腸道組織中有高水

8、平表達,推測其產物可能參與代謝抗性水稻的有毒次生物質。
　　 以B-actin為參照基因,采用半定量PCR技術檢測了褐飛虱CYP6CW1、CYP4C61在褐飛虱體壁、脂肪體、中腸組織中的相對表達量。結果表明,CYP6CW1主要在中腸組織中表達,而CYP4C61則主要在脂肪體中表達,由此進一步推斷CYP6CW1可能參與了水稻次生物質的代謝,而CYP4C61可能參與內源性物質的代謝。本研究為深入了解P450基因在褐飛虱的生長發(fā)育及適