棉鈴蟲細(xì)胞色素P450 CYP9A亞家族的表達(dá)調(diào)控機(jī)理及進(jìn)化關(guān)系研究.pdf

1、棉鈴蟲是一種世界性重要害蟲,棉鈴蟲對擬除蟲菊酯的抗性是與棉花安全生產(chǎn)密切相關(guān)的重要問題。國內(nèi)外大量研究表明,細(xì)胞色素P450基因過量表達(dá)導(dǎo)致的解毒作用增強(qiáng)是棉鈴蟲對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理。本文對與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯抗性相關(guān)的3個P450基因CYP9A12,CYP9A14和CYP9A17的基因結(jié)構(gòu)和5’-端基因表達(dá)調(diào)控區(qū)進(jìn)行克隆、測序和進(jìn)化關(guān)系分析,為棉鈴蟲P450基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究奠定了一定基礎(chǔ)。 1.棉鈴蟲細(xì)胞色素P

2、450 CYP9A亞家族基因組的克隆和序列分析根據(jù)已獲得棉鈴蟲CYP9A亞家族中CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2的cDNA序列設(shè)計引物,在標(biāo)準(zhǔn)敏感品系SCD、擬除蟲菊酯抗性品系YGF以及抗性對照品系YG中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得這3個基因的全長基因組序列,利用GeneDoc軟件對所獲得的基因組序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,基因CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2均存在9個內(nèi)含子,且插入位點(diǎn)極其相近。已有的研

3、究表明基因CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2位于同一進(jìn)化分枝。推測這3個基因源于同一始祖基因,進(jìn)化的機(jī)制可能是通過基因的重復(fù)拷貝以及隨后的歧異。 2.棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因非翻譯區(qū)的克隆和序列分析細(xì)胞色素P450 CYP9A亞家族部分基因的過量表達(dá)已被證實(shí)與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯的抗性相關(guān)。為探明棉鈴蟲細(xì)胞色素P450 CYP9A亞家族基因(CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2)的表達(dá)調(diào)控機(jī)理,根據(jù)

4、本實(shí)驗(yàn)室已獲得的棉鈴蟲CYP9A亞家族基因全長基因組的5’-末端核苷酸序列,設(shè)計幾組反向特異性引物,進(jìn)行基因組步移,分別獲得棉鈴蟲敏感品系SCD以上3個P450基因的5’-非翻譯序列,再根據(jù)所獲得的序列設(shè)計引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,分別獲得棉鈴蟲擬除蟲菊酯抗性品系YGF以及抗性對照品系YG的5’-非翻譯區(qū)序列。通過NNPP在線分析軟件分別預(yù)測出各基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),并利用TFSEARCH 1.3在線分析軟件預(yù)測出上游啟動子區(qū)域內(nèi)各轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合

5、位點(diǎn)。通過敏感與抗性品系5’-非翻譯區(qū)序列的比較,分析其差異位點(diǎn),為下一步深入研究棉鈴蟲中細(xì)胞色素P450的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其參與殺蟲劑抗性的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 3.昆蟲細(xì)胞色素P450 CYP9A亞家族的基因進(jìn)化根據(jù)GenBank以及相關(guān)的P450網(wǎng)站已提交的CYP9家族的序列,通過序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,初步確定CYP9家族源自同一個始祖基因,經(jīng)基因重復(fù)以及隨后的歧異進(jìn)而形成功能的分化,而內(nèi)含子的丟失亦是造成分化的重要原因之一。