柑桔潰瘍病菌二硫鍵穩(wěn)定Fv抗體基因的構(gòu)建及產(chǎn)物生物學(xué)特性研究.pdf

1、重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文柑桔潰瘍病菌二硫鍵穩(wěn)定Fv抗體基因的構(gòu)建及產(chǎn)物生物學(xué)特性研究姓名：李泮志申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：王中康20090602重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要①通過重疊延伸P C R 方法，以s c F v 基因?yàn)槟０澧魍ㄟ^4 輪P C R 擴(kuò)增，V L通過2 輪P C R 擴(kuò)增，成功的將半胱氨酸突變位點(diǎn)引入V H 的4 4 位和V L 的1 0 0 位，測(cè)序結(jié)果表明基因序列正確。分別酶切后連接入表達(dá)載體p

2、E T 3 0 a ( + ) ，并成功轉(zhuǎn)化入大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) q b 。②對(duì)V H 和V L 進(jìn)行I P T G 誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物絕大多數(shù)以包涵體的形式存在。S D S ．P A G E 分析表明V H 和V L 的大小均為2 3 k d ，與預(yù)期相符。W e s t e r n ．b l o t檢測(cè)到目的條帶說明表達(dá)產(chǎn)物正確。③將表達(dá)的V H 和V L 包涵體分別用鹽酸胍溶解后按摩爾比l ：1 的比例混合

3、稀釋于復(fù)性緩沖液中復(fù)性后，非還原S D S ．P A G E 、還原性S D S ．P A G E 及w e s t e r n ．b l o t分析表明V H 與V L 成功復(fù)性為X a c ．d s F v ，其大小為4 6 k d 。利用H i s T r a pH P 柱對(duì)復(fù)性后的X a c ．d s F v 進(jìn)行純化，灰度分析表明其純度達(dá)到8 3 ．2 7 ％。④用B I A c o r e 大分子相互作用儀對(duì)X a c ．d

4、 s F v 抗體的親和力進(jìn)行分析，結(jié)果表明X a c ．d s F v 對(duì)其抗原X a c 的脂多糖L P S 具有很高的親和力，結(jié)合常數(shù)( k a ) 為5 ．4 8X 1 0 8 M 1 s ～，解離常數(shù)( 姍為5 ．4 7 X 1 0 。2 s ．1 ，親和常數(shù)怖) 為9 ．9 8 ×1 0 - 1 0 M 。用D o t ．b l o t和E L I S A 對(duì)X a c ．d s F v 的特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明

5、其對(duì)X a c 具有較高的特異性，對(duì)其它l O 種對(duì)照細(xì)菌均無(wú)非特異性交叉反應(yīng)。⑤對(duì)復(fù)性X a e ．d s F v 抗體進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢測(cè)。以X a c ．s c F v 抗體為對(duì)照，檢測(cè)X a c —d s F v 抗體在P B S 中，3 7 ℃孵育不同時(shí)間和相同的時(shí)間孵育在不同的溫度中抗原結(jié)合活性的變化。結(jié)果表明，在3 7 ℃條件下，X a c ．s c F v 2 4 h 后已經(jīng)基本檢測(cè)不到活性。X a c ．d s F v 在

6、7 2 h 后仍然保持最初活性的6 1 ．3 ％。X a c ．s c F v 在3 5 ℃孵育3h活性下降到最初的3 0 ．7 ％，在4 5 ℃時(shí)活性完全喪失，而X a c ．d s F v 在4 5 ℃仍具有5 2 ．6 ％的活性，5 5 ℃基本喪失活性。說明X a c ．d s F v 抗體的穩(wěn)定性與X a c —s c F v 相比有了明顯的提高，提高近2 0 ℃。關(guān)鍵詞：柑桔潰瘍病菌；二硫鍵穩(wěn)定F v 抗體；包涵體；復(fù)性；B