二硫鍵對人朊蛋白生化特性和功能的影響.pdf

1、本研究主要圍繞二硫鍵在人朊病毒蛋白分子huPrP23-231中的作用展開，首先通過體外對純化的原核重組人正常朊蛋白硫醇基團(tuán)的氧化還原過程，測定二硫鍵的改變對其生化特性的影響；進(jìn)而探究了N端八肽重復(fù)區(qū)序列對二硫鍵形成的硫醇基團(tuán)的氧化還原過程介導(dǎo)的聚集和纖維化的敏感性，最后進(jìn)行了部分二硫鍵相關(guān)突變體質(zhì)粒的構(gòu)建，和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染。蛋白沉淀實驗顯示重組正常人朊病毒蛋白經(jīng)過硫醇基團(tuán)的氧化還原過程明顯增加了其聚集性，而八肽重復(fù)區(qū)缺失和插入型突變體蛋白

2、則沒有明顯變化；硫磺素T(Thioflavin T，ThT)實驗測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過硫醇基團(tuán)的氧化還原過程重組PrP蛋白的纖維形成增多，同樣的八肽重復(fù)區(qū)突變體蛋白無明顯變化；圓二色譜（Circular Dichroism, CD）測定顯示，處理后的重組PrP蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其β-折疊結(jié)構(gòu)比例顯著增多，八肽重復(fù)區(qū)突變體蛋白的β-折疊則減少；蛋白酶K消化實驗也進(jìn)一步顯示硫醇基團(tuán)的氧化還原后 PrP的蛋白酶K抵抗能力有所增加，而八肽重復(fù)區(qū)突變

3、體蛋白的蛋白酶K抗性增加更明顯。這些結(jié)果提示二硫鍵的形成可明顯地改變PrP的二級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)朊蛋白聚集和成纖維過程，而且正常的5個八肽重復(fù)區(qū)序列對蛋白穩(wěn)定的構(gòu)象轉(zhuǎn)變是必需的。為進(jìn)一步研究二硫鍵的作用，構(gòu)建了二硫鍵相關(guān)的突變體質(zhì)粒pQE30-C214G、pQE30-C179G/C214G、pQE30-M166C/E221C，并進(jìn)行了測序和酶切鑒定。正在進(jìn)行的和后續(xù)實驗準(zhǔn)備通過原核表達(dá)、純化并進(jìn)行硫醇基團(tuán)的氧化還原過程，進(jìn)行上述參數(shù)測定；并且