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1、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein Disulfide Isomerase,PDI)是廣泛存在于真核類生物中的一種多功能酶蛋白,它參與催化二硫鍵間的氧化還原反應(yīng)、重排錯(cuò)配二硫鍵,幫助新生肽的合成、加工和運(yùn)輸,催使成熟多肽正確折疊,不僅與植物籽粒器官的氮代謝存在較密切聯(lián)系,而且在植物響應(yīng)逆境脅迫的有關(guān)生理過程中起重要作用。本文以日本晴為受體材料,分別構(gòu)建了PDI基因沉默和超表達(dá)載體,并通過愈傷組織轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因植株,對(duì)PDI基因沉默和超
2、表達(dá)后的水稻植株表型、結(jié)實(shí)性狀和部分重要品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定;在此基礎(chǔ)上,通過人工控溫處理試驗(yàn),對(duì)PDI基因沉默和超表達(dá)載體后的有關(guān)基因表達(dá)變化及其與水稻耐熱生理指標(biāo)間的關(guān)系進(jìn)行了研究分析。本研究主要內(nèi)容包括:
?、艑?duì)水稻PDI基因的生物信息分析表明,PDI基因的保守性很高,尤其是其起催化作用的功能結(jié)構(gòu)域a和a'異常保守,以野生型日本晴籽粒為材料,通過RNAi技術(shù)和超表達(dá)技術(shù),分別構(gòu)建了pTCK303-RiOsPDI和pTCK30
3、3-OsPDI載體,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株;通過對(duì)其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鑒定,證實(shí)靶基因已整合到日本晴的基因組;對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株的半定量RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,靶基因在PDI沉默植株不同器官中的表達(dá)量均顯著降低,尤其是在籽粒中的表達(dá)水平受到明顯抑制,而超表達(dá)則會(huì)引起靶基因在水稻籽粒等器官的表達(dá)量有所提升,在水稻籽粒灌漿不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于野生對(duì)照日本晴,表明本文獲得的PDI沉默和超表達(dá)轉(zhuǎn)基
4、因水稻對(duì)靶基因的抑制或超表達(dá)效果明顯。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因T2代植株的結(jié)實(shí)特性和部分重要品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明,PDI沉默水稻的千粒重有所下降,堊白米率和堊白度升高;但其籽??偟鞍缀?、直鏈淀粉含量和蛋白組分(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白)含量與野生對(duì)照之間的差異不甚明顯。與野生對(duì)照相比,PDI沉默植株的總蛋白含量有所下降,直鏈淀粉含量上升,四種蛋白組分含量也產(chǎn)生一定變化。
?、埔赞D(zhuǎn)基因T2代植株為材料,通過在不同溫度處理下的水稻
5、籽粒動(dòng)態(tài)取樣,對(duì)PD1沉默和超表達(dá)后,水稻籽粒灌漿過程中的部分重要熱激蛋白類基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和有關(guān)生理指標(biāo)及其對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)差異,結(jié)果表明,高溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)PDI基因的上調(diào)表達(dá),與此同時(shí),稻米堊白米率和堊白度也會(huì)顯著上升,供試材料(PDI沉默、超表達(dá)與野生對(duì)照日本晴)表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì),但PDI沉默會(huì)降低水稻的耐熱特性,其在高溫脅迫下的結(jié)實(shí)率下降幅度大于其野生型對(duì)照和超表達(dá)植株,其遭遇高溫脅迫處理后的堊白米率和堊白度增加幅度也相對(duì)較大;
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