二硫鍵異構(gòu)酶ERp72在靜脈血栓形成中的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：靜脈血栓形成（Venous Thrombosis）導(dǎo)致的靜脈血栓栓塞癥（Venous Thrombus Embolism，VTE）是一種嚴(yán)重地威脅人類(lèi)生命健康的疾病，目前沒(méi)有理想的治療藥物，主要原因之一是靜脈血栓的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制仍不清楚。近幾年，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）家族在調(diào)控血栓形成中的作用日益受到關(guān)注，P D I家族的不同成員分別在內(nèi)皮細(xì)胞活化，血小板聚集，白細(xì)胞募集

2、，凝血系統(tǒng)激活以及纖維蛋白沉積等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，這為認(rèn)識(shí)靜脈血栓形成過(guò)程提供了新的研究思路。ERp72是PDI家族的重要成員，它含有三個(gè)PDI家族高度保守的同源序列，廣泛表達(dá)于血小板，白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。本研究建立了ERp72組織特異性敲除小鼠，并制備了重組ERp72蛋白和抑制型抗ERp72單克隆抗體，通過(guò)觀察ERp72的缺陷和活性抑制在小鼠靜脈血栓模型中的表型，認(rèn)識(shí)ERp72在靜脈血栓形成中的作用，并初步探討其作用機(jī)制。
　

3、　方法：⑴構(gòu)建ERp72-loxp（ERp72fl/fl）小鼠，將ERp72fl/fl小鼠和 Pf4-cre、Tie2-cre小鼠交配，獲得 Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠（血小板 ERp72特異性敲除小鼠）和Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠（內(nèi)皮及造血系ERp72特異性敲除小鼠）。通過(guò)基因組PCR鑒定小鼠基因型；通過(guò)Western blot鑒定小鼠血小板、白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中ERp72表達(dá)水平。⑵獲取Tie2-cre

4、/ERp72fl/fl和Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及其對(duì)照小鼠全血，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。分離 Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠及對(duì)照小鼠血漿，檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間（Prothrombin Time,PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）。⑶使用Tie2-cre/ERp72fl/fl和Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及其對(duì)照小鼠，建立

5、小鼠下腔靜脈狹窄血栓模型，48小時(shí)后，取下腔靜脈血栓稱(chēng)重并統(tǒng)計(jì)。使用C57BL/6小鼠建立小鼠下腔靜脈狹窄模型，并從尾靜脈注射250?g重組無(wú)酶活性ERp72蛋白(ERp72oo-oo-oo)或等體積對(duì)照溶液，48小時(shí)后，取下腔靜脈血栓稱(chēng)重并統(tǒng)計(jì)。⑷將Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠及對(duì)照小鼠下腔靜脈狹窄6小時(shí)后，從狹窄處近心端采血400?l，應(yīng)用ELISA檢測(cè)血漿血管性血友病因子（von Willebrand Factor，

6、vWF）水平。⑸從Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及對(duì)照小鼠全血中分離血小板，使用 thrombin或convulxin刺激，檢測(cè)血小板聚集功能。⑹將人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PeripheralBloodMonocuclear Cell，PBMC）分別與ERp72單克隆抗體或同型對(duì)照IgG預(yù)孵育，100ng/ml脂多糖（LPS）刺激4小時(shí)上調(diào)組織因子（Tissue Factor，TF）表達(dá)，應(yīng)用凝血酶生成分析（Thrombin Ge

7、neration Assay，TGA）檢測(cè)兩組 PBMC的凝血酶生成能力。使用負(fù)篩選方法分選Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠及對(duì)照小鼠骨髓單核細(xì)胞，100ng/ml LPS刺激4小時(shí)后，流式檢測(cè)TF表達(dá)水平。⑺將重組野生型ERp72蛋白（ERp72ss-ss-ss）與凝血因子FXII（FXII）37℃孵育1小時(shí)，加巰基標(biāo)記劑MBP室溫孵育15分鐘，通過(guò)非還原條件SDS-PAGE電泳和免疫印跡，檢測(cè)FXII自由巰基變化。

8、　　結(jié)果：①PCR結(jié)果表明ERp72fl/fl小鼠的 ERp72基因成功插入 loxp位點(diǎn)，Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠和 Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠基因組分別成功融合 Pf4-cre和Tie2-cre位點(diǎn)；Western結(jié)果顯示，Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠和 Tie2-cre/ERp72fl/fl兩種敲除小鼠血小板 ERp72均表達(dá)缺失，Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)

9、胞ERp72表達(dá)缺失，所有這些ERp72敲除細(xì)胞PDI，ERp57等同源蛋白均表達(dá)正常。②兩種基因敲除小鼠的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)與野生型小鼠相比均無(wú)差異；Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠血漿凝血酶原時(shí)間PT和活化部分凝血活酶時(shí)間APTT正常，說(shuō)明ERp72不參與骨髓造血功能和凝血蛋白合成。③在小鼠下腔靜脈狹窄血栓模型中，與對(duì)照野生型小鼠組相比，Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠下腔靜脈中形成的血栓重量沒(méi)有明顯差異[20.58±2

10、.20?g(n=8)vs16.97±1.42?g(n=12),P=0.1648]，而Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠下腔靜脈中形成的血栓明顯減小[30.08±3.02?g(n=8)vs16.04±3.03?g(n=7)，P=0.0062]。與尾靜脈注射對(duì)照溶液的小鼠相比，注射重組ERp72無(wú)酶活蛋白ERp72oo-oo-oo的小鼠下腔靜脈中形成的血栓明顯減小[23.84±2.97?g(n=8)vs12.04±2.32?g(n=

11、8)，P=0.0074]。④在未干預(yù)情況下，ERp72fl/fl小鼠和Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠血漿vWF含量沒(méi)有明顯差異[95.30±11.66ng/ml(n=4)vs91.80±15.46ng/ml(n=4)，P=0.8648]；下腔靜脈狹窄6小時(shí)后，兩組血漿vWF含量均有增加，但敲除小鼠血漿vWF含量明顯低于對(duì)照組小鼠[156.9±3.42ng/ml(n=5)vs120.2±10.32ng/ml(n=5)，P=0.

12、0188]。⑤與對(duì)照小鼠血小板相比，使用thrombin或convulxin刺激的Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠血小板聚集功能明顯減弱。⑥與對(duì)照IgG相比，抗ERp72單克隆抗體處理的PBMC受LPS刺激后，凝血酶生成峰值明顯降低[77.27±2.41nM(n=3)vs52.43±3.87nM(n=3)，P=0.0055]。經(jīng)過(guò) LPS刺激后，與 ERp72fl/fl小鼠骨髓單核細(xì)胞相比，Tie2-cre/ERp72fl/fl