深靜脈血栓形成時(shí)間推斷研究.pdf

1、目的：深靜脈血栓(deep venous thrombosis, DVT)是血液在深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)形成血栓引起的靜脈回流障礙性疾病，血栓脫落可引起肺動(dòng)脈栓塞(pulmonary embolism, PE)。兩者在形成過程、發(fā)病機(jī)制及治療上頗為相似，常將兩者合稱為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism, VTE)。VTE發(fā)病率僅次于急性冠狀動(dòng)脈綜合征和腦卒中，其危害范圍廣而嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，血栓栓塞致死案件約占法醫(yī)病理學(xué)

2、鑒定案例死亡原因的5％。臨床上常根據(jù)血液學(xué)、影像學(xué)等手段來診斷肺栓塞；而法醫(yī)檢案過程中遇到的致命性肺栓塞案例，通過尸體解剖肉眼可見明顯肺動(dòng)脈血栓及下肢深靜脈(通常是腘靜脈)血栓形成，并結(jié)合常規(guī)法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)此作出鑒定。但VTE的發(fā)生常見于創(chuàng)傷、制動(dòng)等存在的前提下，法醫(yī)鑒定時(shí)需闡明創(chuàng)傷與肺栓塞之間是否存在因果關(guān)系，若涉及多項(xiàng)危險(xiǎn)因素并存，需闡明這些因素參與程度的大小即傷病參與度，血栓形成時(shí)間、及其與創(chuàng)傷存在時(shí)間上的先后、血栓來源等問

3、題。目前關(guān)于血栓形成時(shí)間推斷尚缺乏系統(tǒng)研究，在法醫(yī)鑒定時(shí)也缺乏有效指標(biāo)和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。而血栓形成時(shí)間推斷研究對(duì)解決上述法醫(yī)鑒定問題具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠下腔靜脈血栓形成模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合該類案件法醫(yī)鑒定的組織標(biāo)本，采用HE染色、Von Kossa染色、Perl’s染色、Masson三色法染色及免疫組織化學(xué)染色方法，對(duì)血栓形成部位的組織病理學(xué)改變進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，研究血小板膜糖蛋白-Ⅲa(CD61)、平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)

4、、CD34在血栓形成不同時(shí)間點(diǎn)的變化規(guī)律，以期為血栓形成時(shí)間推斷的法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：大鼠下腔靜脈血栓HE染色、Von Kossa染色、Perl’s染色、Masson染色和免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)分組：健康清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠80只，體重250g±10g，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周，按完全隨機(jī)分組方法隨機(jī)分為下腔靜脈狹窄術(shù)后0h、3h、6h、12h、1d、3d、1w、2w、

5、3w和4w等10組，每組8只。建立下腔靜脈“狹窄法”動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，按上述分組時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠進(jìn)行下腔靜脈取材，取材后立即放入10%中性甲醛中固定，對(duì)血栓形成部位進(jìn)行HE染色、Von Kossa染色、Perl’s染色及Masson染色，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法觀察血栓形成過程中各組CD61、α-SMA、CD34表達(dá)的變化。
　　2人組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)：回顧性分析河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心肺栓塞死亡案例，對(duì)下肢深靜脈及肺動(dòng)脈血栓部位石蠟包埋組織

6、塊切片后進(jìn)行HE染色及 CD61、α-SMA、CD34免疫組織化學(xué)染色，觀察其組織病理學(xué)形態(tài)變化及上述蛋白的表達(dá)變化，分析血栓形成時(shí)間與創(chuàng)傷時(shí)間的關(guān)系。
　　數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference, LSD)作兩兩比較，以P<0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

7、結(jié)果：
　　1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.1下腔靜脈血栓染色
　　1.1.1下腔靜脈血栓HE染色0h組血管內(nèi)淤血樣改變；3h組、6h組管腔內(nèi)部附壁白色血栓形成，并向血管腔延伸，其間可見少許纖維素樣成分析出，中性粒細(xì)胞開始增多；12h組血小板小梁大量形成并聚集成片狀,至1d組達(dá)其峰值，小梁間充滿紅白細(xì)胞；3d組血栓與管壁接觸面可見成纖維細(xì)胞；1w-3w組血栓收縮，內(nèi)部出現(xiàn)裂隙，裂隙表面可見內(nèi)皮細(xì)胞，新生血管形成，血栓增生樣改變，管

8、壁緊密黏著的血栓開始機(jī)化，大量纖維成分由黏著部位向血栓內(nèi)部浸潤(rùn)生長(zhǎng)，單核細(xì)胞胞核增大，含鐵血黃素滲出，巨噬細(xì)胞體積增大數(shù)量增多，鈣鹽形成，二次狹窄管腔可見少量新生白色血栓；4w組血管內(nèi)膜增生樣改變，血栓被機(jī)化組織取代，血管再通。
　　1.1.2下腔靜脈血栓Perl’s染色 Perl’s染色可將含鐵血黃素顆粒染成藍(lán)色。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含鐵血黃素顆粒最早見于建模3d組，其散落于血栓內(nèi)部；1w-3w組含鐵血黃素含量迅速增多，且常位于與血管壁粘

9、連的血栓邊緣部位，但血栓內(nèi)部亦可見，3組間比較無明顯差異；4w組機(jī)化的血栓組織中含鐵血黃素顆粒大量沉積，與各組間比較有明顯差異(P<0.05)。
　　1.1.3下腔靜脈血栓Von Kossa染色 Van Kossa氏銀染色法(VK染色)可將鈣鹽沉積染成黑色。1w-2w組鈣鹽沉積散在分布于機(jī)化的血栓組織的邊緣部位，兩組比較無明顯差異；隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，3w、4w組包含大量鈣鹽的異物巨噬細(xì)胞體積增大數(shù)量增多，未經(jīng)吸收的鈣鹽直接存在于

10、血栓組織中，鈣化形成靜脈石。隨時(shí)間延長(zhǎng)各組鈣鹽沉積量呈增多趨勢(shì)。3w、4w組分別與各組比較有明顯差異(P<0.05)。
　　1.1.4下腔靜脈血栓Masson染色 Masson染色可將膠原纖維、粘液染呈綠色，胞漿、肌肉、纖維素呈紅色、胞核呈清晰黑藍(lán)色。1-3d組血栓內(nèi)膠原沉積區(qū)域較少；隨建模時(shí)間延長(zhǎng)，膠原沉積由血栓邊緣部逐漸向血栓內(nèi)部蔓延，至4w組可見大量膠原沉積，充滿整個(gè)管腔。3d、1w和2w各組間比較無明顯差異，3w、4w組與

11、各組比較有明顯差異(P<0.05)。
　　1.2下腔靜脈血栓免疫組織化學(xué)染色
　　1.2.1下腔靜脈血栓CD61免疫組織化學(xué)染色3h組血栓形成部位散在表達(dá)；6h組靠近管壁的層狀血小板小梁內(nèi)表達(dá)；至1d組達(dá)到表達(dá)峰值，3d、1w組CD61表達(dá)顯著下降；2-4w組僅在二次狹窄的管腔內(nèi)血栓再形成部位表達(dá)。1d組與各組比較差異明顯(P<0.05)；
　　1.2.2下腔靜脈血栓α-SMA免疫組織化學(xué)染色α-SMA為平滑肌動(dòng)蛋白，

12、在血栓機(jī)化過程中表達(dá)于成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在3d組內(nèi)血栓的邊緣發(fā)現(xiàn)少許α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)；1w組達(dá)到表達(dá)高峰，2-4w組僅在部分新生成的毛細(xì)血管壁內(nèi)表達(dá)，1w組與各組比較有明顯差異(P<0.05)。
　　1.2.3下腔靜脈血栓CD34免疫組織化學(xué)染色 CD34為血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD34最早于3d組靠近管壁部位的血栓內(nèi)散在表達(dá)；1w組新生血管形成增加，CD34表達(dá)占原血管腔面積的7%；2-4w組新生血管密集融合，4w

13、組 CD34表達(dá)面積可達(dá)原血管腔面積的22.8%，其內(nèi)可見紅細(xì)胞成分。3d組與1w組比較無明顯差異，4w組與3d和1w組比較有明顯差異(P<0.05)，2w、3w、4w間相互比較無明顯差異。
　　2人體組織實(shí)驗(yàn)
　　2.1深靜脈血栓HE染色早期血栓血小板黏附聚集于管壁裸露膠原，附壁血栓形成混合血栓頭部，纖維素滲出；隨后血小板大量聚集，進(jìn)而進(jìn)展形成大量血小板小梁，小梁網(wǎng)絡(luò)紅白細(xì)胞、纖維素形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，交替形成混合血栓?；旌涎?/p>

14、逐漸增大阻塞管腔，紅細(xì)胞聚集形成血栓尾部。血栓形成晚期內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞向血栓內(nèi)部生長(zhǎng)，血栓開始機(jī)化，較大血栓收縮內(nèi)部出現(xiàn)裂隙內(nèi)皮細(xì)胞附于表面，新鮮毛細(xì)血管形成，進(jìn)而融合成較大管腔血管，血管再通；血栓脫落可形成肺栓塞。
　　2.2靜脈血栓免疫組織化學(xué)染色肺動(dòng)脈CD61片狀表達(dá)（創(chuàng)傷骨折23天死亡案例）；腘靜脈血栓形成部位邊緣α-SMA陽(yáng)性表達(dá)（骨折31天死亡案例）；腘靜脈形成血栓內(nèi)部CD34大量表達(dá)（骨折43天死亡案例）。

15、>　　結(jié)論：
　　1大鼠模型靜脈血栓特殊染色（VK染色、Perl’s染色、Masson染色）和免疫組織化學(xué)染色（CD61、α-SMA、CD34）均發(fā)現(xiàn)血栓形成不同時(shí)間分期的變化特點(diǎn)：CD61可用于血栓形成超早期及血栓再形成時(shí)期，Perl’ s染色可用于血栓形成中期；而Masson染色和α-SMA則可用于血栓形成中晚期；VK染色及CD34可用于血栓轉(zhuǎn)歸過程晚期的時(shí)間推斷。以上血栓形成不同時(shí)間的推斷的特異性特點(diǎn)可為法醫(yī)血栓形成時(shí)間推斷