抗人脂多糖結(jié)合蛋白二硫鍵穩(wěn)定性Fv抗體的構(gòu)建表達及生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、G-桿菌感染過程中，其產(chǎn)生的內(nèi)毒素引起的感染性休克和多器官功能障礙綜合癥(multipleorgansdysfunctionsyndrome，MODS)被認(rèn)為是感染及內(nèi)毒素血癥患者死亡的根本原因。細(xì)菌內(nèi)毒素又稱為脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)，是該類病癥的主要致病物質(zhì)。脂多糖結(jié)合蛋白(LipopolysaccharideBindingProtein，LBP)是一種促進LPS與效應(yīng)細(xì)胞受體相結(jié)合的關(guān)鍵載體蛋白，在炎

2、癥反應(yīng)過程中具有重要的作用。研究表明，LBP能顯著促進LPS與單核/巨噬細(xì)胞膜表面的CD14(membraneCD14mCD14)結(jié)合，形成LPS-LBP-mCD14復(fù)合物，經(jīng)TLR4-MD-MYD88和NF-KappaB途徑，激活單核/巨噬細(xì)胞，促進炎癥的發(fā)生、發(fā)展；LBP的N、C端分別為與LPS和mCD14的結(jié)合區(qū)，因此若能研究獲得針對LBP的抗體，特別是針對LBPN端(N-teminatalfragmentofhumanLBP，N

3、H-LBP)的抗體，則可能阻斷LPS與LBP的結(jié)合，從而降低內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低G-桿菌感染及膿毒性休克的死亡率。 本研究以人LBP及人NH-LBP為抗原，對本課題組構(gòu)建的人源噬菌體抗體庫(Fab)進行篩選，獲得針對人源LBP及人源NH-LBP均有高結(jié)合力的單克隆抗體菌株；通過mega-PCR引入半胱氨酸(Cys)及酶切位點，并連接表達載體pET-28a(+)，使得dsFvVH鏈和dsFvVL鏈分別在工程菌BL21star

4、(DE3)中高效表達。抽提其包涵體并純化，隨后使dsFvVH鏈和dsFvVL鏈蛋白在體外復(fù)性，通過半胱氨酸形成二硫鍵(-S-S-)連接，獲得完整的針對LBP特別是NH-LBP的二硫鍵穩(wěn)定Fv單克隆抗體(disulfidestabilizedFvfragmentantibodydsFv)，并初步研究其體內(nèi)外生物學(xué)活性。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1、以人LBP為抗原，以人源噬菌體抗體庫(Fab)進行5輪篩選，在篩選過程

5、中使抗體效價由3.8×108升高為3.1×1013，提高倍數(shù)為8.15×104倍，證明篩選效果良好。 2、獲得的抗體庫質(zhì)粒(pComb3H)切除geneⅢ后，以LBP及NH-LBP為抗原經(jīng)ELISA法鑒定，獲得編碼與人LBP及NH-LBP皆有高結(jié)合力的單克隆抗體菌株(4號菌)，其表達抗體的結(jié)合力對于LBP為陰性對照的4.2倍，對于NH-LPB為陰性對照的3.8倍；通過對4號菌的質(zhì)粒序序列測定及其表達上清的Western-Blot

6、ting檢測，確定其表達的可溶性抗體Fab與LBP和NH-LBP可良好結(jié)合。 3、經(jīng)mega-PCR獲得dsFvVL/dsFvVH片段，克隆到T載體并測序正確后，亞克隆至表達載體pET-28a，在BL21star菌中可分別表達dsFvVL/dsFvVH抗體片段；SDS-PAGE電泳及Western-Blotting實驗顯示獲得的目的蛋白大小約為26kDa及32kDa。 4、含dsFvVL或dsFvVH的菌株，誘導(dǎo)表達后分

7、別抽提其包涵體，TALON柱芯親和純化；將純化后的dsFvVL、dsFvVH共同溶解于復(fù)性緩沖液和折疊緩沖液中，加入氧化型谷胱甘肽，使二硫鍵暴露并連接，形成dsFv抗體。再次用TALON柱芯純化，從純化波形可看出獲得dsFv蛋白純度較高。 5、將獲得的dsFv抗體在體外檢測，確認(rèn)獲得dsFvVL蛋白3.38mg，dsFvVH蛋白4.3mg；折疊后dsFv抗體含量為2.1mg，其中1L分泌dsFvVL與1L分泌dsFvVH的大腸桿