引入二硫鍵提高黑曲霉GH11木聚糖酶XynⅢ熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、木聚糖酶在飼料、食品、造紙等領域有廣闊的應用前景。本實驗室篩選的黑曲霉A-25所分泌的β-1，4-內切木聚糖酶屬于G/11家族，最適反應溫度為46℃，不適于在高溫下使用，前期在三個位點引入二硫鍵，其中突變位點分別為S130C與N174C；G30C與D47C；V128C與F178C；并在(S130C與N174C)突變體的C端去掉兩個游離的絲氨酸得到一個新的突變體(S130C/N174C，C端-2S)。經測序后發(fā)現在其N端都存在一段從T載體

2、上酶切下來的基因序列，該序列不屬于突變體正常的基因序列，且只對粗酶的酶學性質進行了分析。
　　 本研究以前期獲得的突變體為模板，通過PCR方法去除其N端多余的屬于T載體的基因序列，連接在pET-20b(+)載體上，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，得到四個序列正確的突變體，在S130C與N174C、G30C與D47C、V128C與F178C位點引入二硫鍵的突變體分別命名為33，F61，G16，在突變體33的C端去掉兩個絲氨酸為

3、突變體S4(33C端-2S)，并進行誘導表達純化，對純酶酶學性質進行了分析。
　　 純酶測定結果顯示：
　　 (1)突變體酶S4，G16，33，最適pH均為3.6，較之野生型降低了0.2，突變體酶F61的最適PH為3.4，較之野生型降低了0.4，各突變體酶的耐酸性得到提高。
　　 (2)突變體酶S4，G16，33，F61的最適溫度均為48℃，較之野生型23號提高了2℃。
　　 (3)在50℃下，各突變體酶

4、S4，F61，33，G16的半失活時間分別為366min、175min、68min、55min，半衰期較之野生型分別延長了13倍、5倍、2倍、1倍，熱穩(wěn)定性得到顯著提高，其中突變體酶S4尤為顯著。
　　 (4)突變體酶S4的Km值略低于野生型23號，底物親和力提高；各突變體酶S4，F61，33，G16的Vmax較野生型酶分別提高了3.2，12.4.，7，2.1倍；突變體酶F61，33的Kcat值比野生型分別提高了29.6，7.7