真菌甘露聚糖酶的基因克隆表達及熱穩(wěn)定性機制初步研究.pdf

1、甘露聚糖酶是一類重要的半纖維素酶，可以廣泛應(yīng)用于飼料、食品、石油開采以及洗滌行業(yè)中。為獲得性質(zhì)優(yōu)良的甘露聚糖酶，本研究在篩選新的甘露聚糖酶的同時，也對現(xiàn)有的甘露聚糖酶進行熱穩(wěn)定性改造，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。
　　從Talaromyces leycettanus JCM12802,Gloeophyllum trabeum CBS900.73, Staphylotrichumcoccosporum NBRC31817和Alternar

2、ia sp.四株真菌中克隆得到五個糖苷水解酶第5家族的甘露聚糖酶基因(rnan5A，man5B，man5D，man5DB和man5DW)和一個第26家族的甘露聚糖酶基因(man26DW)，均在畢赤酵母中成功表達。其中來源于T.leycettanus JCM12802的Man5A是目前報道的作用溫度最高的真菌來源的內(nèi)切β-甘露聚糖酶，最適溫度為90℃，在70℃處理1h仍能保持穩(wěn)定，其最適pH為4.5，在pH3.0-10.0范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定

3、，并且能夠有效降解帶有不同側(cè)鏈的甘露聚糖。來源于G.trabeum CBS900.73的Man5B的最適pH為2.5，屬于極端嗜酸的甘露聚糖酶，在pH2.0-6.0能發(fā)揮80％以上的活力，在pH2.0-10.0處理1h能保持80％以上的酶活，而且Man5B還具有較強的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。在動物的模擬胃腸道實驗中，Man5B對干物質(zhì)的消化程度要高于商業(yè)酶。另外，Man5B優(yōu)異的底物降解能力和轉(zhuǎn)糖苷活性，使其可以應(yīng)用于食品行業(yè)中的甘露寡

4、糖制造。來源于s.coccosporum NBRC31817的Man5D和Man5DB，以及來源于Alternaria sp.的Man5DW和Man26DW的最適pH為5.0-6.0。Man26DW的最適溫度為50℃，其余三者皆在65-70℃之間。上述四個甘露聚糖酶能夠抵抗多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑的作用，能夠較大程度降解含有不同側(cè)鏈的聚糖，而且具有轉(zhuǎn)糖苷作用，因此也可用于天然甘露寡糖的制備。
　　為研究甘露聚糖酶的嗜熱機制，本研究將

5、嗜熱甘露聚糖酶Man5A與第5家族其它具有不同作用溫度的甘露聚糖酶進行多序列比對以及結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Man5A具有一個可能與熱穩(wěn)定性相關(guān)的CBM結(jié)構(gòu)域和兩個獨特的氨基酸（Asp191和Arg286）。因此構(gòu)建了一個截短酶Man5A-CBD和一個突變體D191G/R286H，并成功在畢赤酵母中表達。結(jié)果表明截短酶Man5A-CBD和突變體D191G/R286H的熱穩(wěn)定性均比原酶差，由此確定該CBM結(jié)構(gòu)域和兩個氨基酸影響Man5A的熱穩(wěn)定

6、性。初步研究了Bispora sp.MEY-1來源的Bman的糖基化修飾對其熱穩(wěn)定性的影響，根據(jù)預(yù)測的七個糖基化位點構(gòu)建了15個突變體，發(fā)現(xiàn)絕大部分突變體的熱穩(wěn)定性均有所提高。初步推測糖基化修飾對熱穩(wěn)定性的影響與糖基化位點的位置相關(guān)，而與糖基化位點的數(shù)目無關(guān)。但是具體原因還需要進一步的研究分析。
　　本研究通過基因克隆的方法獲得了六個新的甘露聚糖酶基因并實現(xiàn)了外源高效表達，同時通過定點突變和截短實驗對影響甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素進