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1、THECLONINGANDEXPRESSIONOFflMANNANASEGENEANDITSRECOMBINEDENZYMATICPROPERTIESADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNonTlalUniversitvinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByFluWenboSupe
2、rvisor:ProfZhangJianxinMay,2012摘要類芽孢桿菌cH3(Paenibacilh“spCH一3)是本實驗室從刺槐種子中篩選分離到的一株植物內(nèi)生菌,具有較強(qiáng)的蟑甘露聚糖酶活性,采用簡并PCR和1AILPCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)技術(shù)從該菌基因組DNA中克隆得蓼臟甘露聚糖酶基因(marA)。序列分析表明,該基因開放閱讀框(ORF)為984bp,編碼一個含有327個氨基酸、等
3、電點(diǎn)為701、理論分子量約為35270KDa的蛋白,N端前32個氨基酸為其信號肽。同源性分析顯示t該酶氨基酸序列與來源于PaenibacillusspA1MANAI的氨基酸序列同源性高達(dá)8135%,屬于糖苷水解酶5家族(GH5)的一員。通過對該酶分子三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析,該酶的二級結(jié)構(gòu)由14個a螺旋和15個口折疊股構(gòu)成,其催化域采用一定的折疊方式形成TIM桶狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)表達(dá)載體pET32a()或pET28a()的多克隆位點(diǎn)及目的基因序列特
4、點(diǎn)。選擇BamH,和Sal,酶切位點(diǎn)處作為目的基因的插入位置。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETmanA,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3),經(jīng)過誘導(dǎo)獲得了此酶的高效表達(dá)。對重組聲一甘露聚糖酶酶活力進(jìn)行初步檢測,結(jié)果顯示,酶活力可達(dá)9034U/ml。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS—PAGE凝膠電泳分析,蛋白圖譜顯示1條大約為504KDa(pET28a表達(dá)系為394KDa)的特異性條帶。實驗探討了溫度、誘導(dǎo)物(IPTG)濃度和誘導(dǎo)時間三種單因素對重組肛甘
5、露聚糖酶基因工程菌產(chǎn)酶的影響,并在此基礎(chǔ)上設(shè)計了正交組合試驗,結(jié)果顯示,該菌搖瓶發(fā)酵的最佳條件組合為:發(fā)酵溫度28℃,IPTG005mM,誘導(dǎo)時間12h,且在此發(fā)酵條件下,酶活力可達(dá)105417U/mL,比初始酶活提高了約107倍。各因素對該菌產(chǎn)酶的影響大小依次為誘導(dǎo)物(IPTG)濃度誘導(dǎo)時間瓦作項(溫度IPTG濃度))溫度。50L發(fā)酵罐中進(jìn)行該茁擴(kuò)大培養(yǎng)試驗,結(jié)果表明,在添加誘導(dǎo)物(廿TG)2h后肛甘露聚糖酶的活力就已達(dá)到較高水平,誘
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