甘露寡糖誘導(dǎo)抗病反應(yīng)初步研究及枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、甘露寡糖是由2-10個(gè)葡萄糖、甘露糖分子構(gòu)成的甘露低聚糖。本研究利用甜瓜-白粉病病害體系檢測(cè)甘露寡糖的誘導(dǎo)抗病作用。結(jié)果證實(shí)甘露寡糖能降低白粉病的發(fā)生。經(jīng)甘露寡糖處理后的甜瓜葉片中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均有不同程度的增強(qiáng)。其中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶分別在第13d和16d達(dá)到最高峰，以后酶的活性逐漸下降至對(duì)照水平；而苯丙氨酸解氨酶的活性一直處于上升趨勢(shì)，后期(5-6d)最為明顯

2、；同時(shí)寡糖也明顯激發(fā)了多酚氧化酶和過氧化物酶活性。 β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一類能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露寡糖、甘露多糖的水解內(nèi)切酶，可以將植物膠水解成由2-10個(gè)單糖分子構(gòu)成的甘露低聚糖。本研究從不同地區(qū)的土樣中分離到高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的一株細(xì)菌Z-2，通過16SrDNA序列同源性分析及生理生化性狀測(cè)定將菌株Z-2鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。對(duì)粗酶性質(zhì)的初步研究證明

3、其酶穩(wěn)定pH范圍較寬，最適pH為6.0；在40-55℃酶活力保持穩(wěn)定，最適溫度為50℃，高于55℃酶活力迅速下降。酶解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析證明為低聚糖，不含單糖。 通過粘粒pLARF-5構(gòu)建菌株Z-2的基因組文庫，通過PCR介導(dǎo)的篩選方法，從Z-2基因組文庫中獲得甘露聚糖酶基因man。以pET22b(+)為載體，構(gòu)建pET-NcoI3和pET-NdeI18兩種表達(dá)載體，E.coliBL21(DE3)為宿主菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，兩種載體都

4、成功的表達(dá)了man基因。pET-NcoI3的Man胞外活性是pET-NdeI18的2倍。為了增加胞外酶的產(chǎn)量，本文對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、IPTG的誘導(dǎo)濃度、菌體的濃度4個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)采用TB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度達(dá)到OD600=0.75時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)4h，培養(yǎng)基中甘露聚糖酶的活力可達(dá)到55.33U/mL，顯著高于野生菌產(chǎn)生酶的活力。 由于野生型man基因在Pseudomonasfluorescens

5、2P24中不表達(dá)或表達(dá)量較低，通過遺傳改造野生man基因的起始密碼子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和信號(hào)肽，構(gòu)建出3個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)，分別連接在穿梭載體pRK415上轉(zhuǎn)化Pseudomonasfluorescens2P24。活性測(cè)定結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不加魔芋粉時(shí)Man誘導(dǎo)活性很低，加入后胞內(nèi)和胞外均誘導(dǎo)目的蛋白的積累，改造后的質(zhì)粒胞外活性為1.55U/mL，胞內(nèi)約為3.8U/mg。苗期生測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入man基因2P24菌株對(duì)煙草花葉病有一定的防病效果。