來(lái)源于Caldibacillus cellulovorans的耐熱甘露聚糖酶的全基因合成,表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、甘露聚糖酶(mannanase)來(lái)源廣泛，大量存在于植物，動(dòng)物和微生物。其中微生物存在種類(lèi)繁多、性質(zhì)優(yōu)良的甘露聚糖酶，且易于培養(yǎng)，是理想的β-甘露聚糖酶來(lái)源。已有大量來(lái)源于細(xì)菌的甘露聚糖酶被研究，其中耐熱甘露聚糖酶的研究仍受到科學(xué)家們的關(guān)注。在食品、飼料等眾多行業(yè)中，需要大量高溫環(huán)境下使用的生物活性添加劑，其相關(guān)高反應(yīng)溫度，耐熱性好的酶類(lèi)仍然缺乏研究。國(guó)內(nèi)外已有研究出的耐熱甘露聚糖酶，目前還沒(méi)有能夠得到很好推廣利用，應(yīng)用很有限，其原因是

2、市場(chǎng)供給不足，酶學(xué)性質(zhì)難以工業(yè)化使用，并且價(jià)格高。挖掘出耐熱效率高并利用高效表達(dá)系統(tǒng)使該甘露聚糖酶進(jìn)行外源高效率表達(dá)，從而低成本、規(guī)?；卮罅可a(chǎn)甘露聚糖酶酶供更多人所用，無(wú)疑是解決這一問(wèn)題的有效方法之一。
　　本研究應(yīng)用基因工程，蛋白工程和發(fā)酵工程技術(shù)獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的甘露聚糖酶高產(chǎn)工程菌，為甘露聚糖酶在食品與飼料方向的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和條件，本研究主要工作包括以下內(nèi)容：在不改變耐熱甘露聚糖酶ManAd3原始氨基酸序列

3、的基礎(chǔ)上，根據(jù)已知耐熱甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列，為了提高甘露聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)量，參照巴斯德畢赤酵母密碼子使用情況，優(yōu)先選擇畢赤酵母最偏愛(ài)的密碼子，部分使用次偏好密碼子，從而盡量消除mRNA穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并全基因合成了甘露聚糖酶基因ManAHr(Accession No.KJ806637)。將人工合成的甘露聚糖酶基因 ManAHr利用基因工程技術(shù)與pPIC9k質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)載體pPIC9k

4、-ManAHr，并將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115得到重組子，該重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其中甘露聚糖酶ManAHr含量達(dá)到電泳純級(jí)別，分子量大小約為30 kDa。通過(guò)發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，尋找重組蛋白的表達(dá)的最佳發(fā)酵條件，通過(guò)甲醇與甘油不同比例的混合補(bǔ)料，有效的避免了甲醇中毒情況，進(jìn)一步提高了甘露聚糖酶的產(chǎn)量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示該酶最適反應(yīng)溫度為75℃，最適反應(yīng)pH為6.0，比活力高達(dá)