底物結(jié)合模塊C1-C2雙端融合提高黑曲霉木聚糖酶穩(wěn)定性和活性.pdf

1、木聚糖酶在造紙、飼料、能源等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。本實驗室從黑曲霉中篩選到GH11家族β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶XynШ(X)，其穩(wěn)定性較低，難以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。實驗室將海棲熱袍菌GH10家族木聚糖酶XynA的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM）融合到X的C端，將CBM拆分為CBM1（C1)和CBM2(C2)，分別融合到X的N端和C端，顯示C1提升X催化能力，C2顯著提高X催化能力和穩(wěn)定性。然而，目前CBM融合研究集中在單端。
　　本課題將C1

2、和C2通過linker融合到X兩端，構(gòu)建C1-X-C1、C1-X-C2、C2-X-C1和C2-X-C2四種融合酶，期待兩端C1、C2相互協(xié)作提升酶的性質(zhì)，論文結(jié)果如下：
　　1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建：利用反向PCR構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET20b-C2-X-C1和pET20b-C1-X-C2。通過優(yōu)化反向PCR，使用兩步退火并調(diào)整Ramp值為0.2℃/s構(gòu)建了帶有重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pET20b-C2-X-C2和pET20b-C1-X-C1。轉(zhuǎn)

3、化BL21（DE3）細(xì)胞后，篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)DNA測序顯示序列正確，而后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，測定了C2-X-C2和C2-X-C1純酶的酶學(xué)性質(zhì)。
　　2）酶學(xué)性質(zhì)：融合酶C2-X-C2和C2-X-C1的最適pH（pHopt)都為4.2，野生型酶X的pHopt為3.8。C2-X-C2和C2-X-C1的最適溫度都為45℃，兩酶酶活在35℃-50℃之間能保持80％以上的酶活，有更廣泛的溫度適性。
　　3）穩(wěn)定性：在50℃保溫下，C

4、2-X-C1的t1/2為4.27h，是X（21.04min）的12倍，X-C2（69.3min）的3.7倍，而C2-X-C2的t1/2為9.4h，比X提高了26.8倍，是X-C2的8倍。在80℃保溫下C2-X-C2的t1/2為2.8h。
　　4）動力學(xué)分析：山毛櫸木聚糖底物時，C2-X-C1的Km值為3.97，C2-X-C2為1.44，X的Km值為2.72，C2-X-C2對山毛櫸底物更高親和力。C2-X-C1的Kcat值是183.

5、39s-1，C2-X-C2的Kcat值為445.15s-1，大約是X（280.79）的1.6倍。
　　燕麥木聚糖底物時，C2-X-C1與C2-X-C2的Km值分別為18.52、13.13與X（19.8）相比，親和力有顯著提升。C2-X-C1和C2-X-C2的Kcat值分別為150.62s-1、774.86s-1，C2-X-C2催化活力約是X（150）的5倍。
　　木聚糖酶兩端同時融合C1、C2結(jié)構(gòu)域，能大幅提升酶的穩(wěn)定性以對