二硫鍵穩(wěn)定的人源性抗bFGF雙鏈抗體在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、目的:為提高小分子抗體表達(dá)量,利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)二硫鍵穩(wěn)定的人源性抗bFGF雙鏈抗體(ds-Diabody)并研究其生物學(xué)活性。
　　方法:從真核表達(dá)載體pLEXm-ds-Diabody中擴(kuò)增出ds-Diabody基因,并將其構(gòu)建到酵母表達(dá)載體中獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-ds-Diabody。測序正確后,經(jīng)BglⅡ線性化電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中,Zeocin加壓篩選高拷貝子,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及West

2、ern-blot鑒定,并進(jìn)行鎳離子親和層析和陰離子交換層析純化。間接ELISA檢測其抗原結(jié)合活性。CCK-8法檢測ds-Diabody對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用,劃痕修復(fù)實驗和Transwell系統(tǒng)檢測其對腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲影響,成管實驗和Transwell檢測其對血管內(nèi)皮細(xì)胞體外成管和遷移的抑制作用,信號通路分析其作用于腫瘤細(xì)胞的機制。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建人源性抗bFGF ds-Diabody酵母表達(dá)載體,并獲得4株高表達(dá)酵母工程

3、菌,經(jīng)1％甲醇誘導(dǎo)96 h表達(dá)量即可恒定,表達(dá)量可達(dá)158mg/L。SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果顯示,目的蛋白大小約35kDa左右。通過兩步純化方案,目的蛋白的純度可達(dá)95%以上。ELISA結(jié)果顯示純化的ds-Diabody可與bFGF更好地特異性結(jié)合,并且具有良好的穩(wěn)定性。CCK-8結(jié)果顯示,純化的ds-Diabody可劑量依賴性地抑制人卵巢癌細(xì)胞株Skov3 cells,人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 cells,人黑色

4、素瘤細(xì)胞株A375 cells和人肺癌細(xì)胞株A549 cells的增殖,最大抑制率分別為24.3%,56.5%,43.4%和35.4%。劃痕實驗和Transwell結(jié)果表明ds-Diabody可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。成管實驗和Transwell顯示ds-Diabody可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管及遷移。信號通路分析結(jié)果表明ds-Diabody能有效阻斷與bFGF相關(guān)的MAPK和Akt通路。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明人源性抗bF