Midkine在畢赤酵母中的表達(dá)純化及其種子庫(kù)的建立.pdf

1、Midkine(MK)作為一種肝素結(jié)合型生長(zhǎng)因子,在胚胎早期的分化發(fā)育、腫瘤、炎癥、再生等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為了克服大腸桿菌表達(dá)純化系統(tǒng)中存在的蛋白復(fù)性難,產(chǎn)品均一性差等問題,我們建立了以畢赤酵母為工程菌的MK重組蛋白真核表達(dá)系統(tǒng),為其藥效、藥理的研究提供充足高質(zhì)量的蛋白原料。
　　考慮到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期給藥的同源性問題,本論文主要包括兩部分的研究?jī)?nèi)容:重組人、重組鼠Midkine(rhMK、rmMK)的真核表達(dá)純化及活性測(cè)定

2、和相應(yīng)種子庫(kù)的建立和檢定。
　　首先,將rhMK全長(zhǎng)基因構(gòu)建到pPICZa(B)表達(dá)載體上,通過化學(xué)轉(zhuǎn)染方法,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至不同酵母菌株中進(jìn)行篩選。利用畢赤酵母的高密度發(fā)酵進(jìn)行表達(dá),純化出高純度的rhMK。1.2L發(fā)酵液中得到了124.6 mg內(nèi)毒素含量在1.4-7.0 EU/mg,高純度、有活性的rhMK蛋白,符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。
　　其次,構(gòu)建rmMK優(yōu)化序列的蛋白表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入X33中,通過高密度發(fā)酵,最后1.2L發(fā)酵液在

3、50ml的SP Sepharose FF層析柱進(jìn)行純化后,得到了280mg內(nèi)毒素含量在0.56EU/mg,純度大于99％的rmMK蛋白,同時(shí)當(dāng)rmMK的蛋白濃度在20μg/ml時(shí),對(duì)UMR106細(xì)胞有很好的趨化作用。MK的真核表達(dá)與純化方法的建立為后續(xù)的藥效學(xué)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),并對(duì)其它蛋白的真核表達(dá)、純化也有一定的參考意義。
　　最后,根據(jù)上述發(fā)酵rhMK菌株,建立了相應(yīng)的原始種子庫(kù)、主種子庫(kù)和工作種子庫(kù)。各級(jí)種子庫(kù)在YPD平板上都