漢坦病毒S基因克隆及其在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、腎綜合征出血熱是一類危害較大的新現(xiàn)病毒性疾病,漢坦病毒是它的病原體,在中國以漢灘型和漢城型為主,其代表毒株分別為Z10株和L99株.在病毒的基因組中S基因所編碼的核蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分.核蛋白具有很強(qiáng)的抗原性及免疫原性,高度保守,患者對核蛋白的抗體應(yīng)答不僅出現(xiàn)的早且滴度高.因此,核蛋白可以用作理想的診斷抗原.巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng),兼有原核細(xì)胞良好的

2、可操作性和真核系統(tǒng)的后加工,表達(dá)基因插入整合在染色體上更為穩(wěn)定,且發(fā)酵條件簡單,適宜高密度培養(yǎng),具高效表達(dá)的優(yōu)勢,易于純化,為其產(chǎn)業(yè)化提供極大方便.該文分別從漢坦病毒漢灘型Z10株和漢城型L99株感染的Vero-E6細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得全長S基因片段,插入pGEM-T-Easy載體中,經(jīng)酶切鑒定及序列分析,證實(shí)了基因片段的正確插入.繼而,將重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-Z10-S和pGEM-T-Easy-L99-

3、S中的外源片段插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZα,經(jīng)酶切鑒定及核苷酸序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒pPICZαA-Z10-S和pPICZαC-L99-S的讀碼框架正確,并經(jīng)3D-PASSM server軟件分析預(yù)測目的蛋白空間結(jié)構(gòu)無改變.重組質(zhì)粒經(jīng)SacI酶切線性化后導(dǎo)入畢赤酵母菌X-33進(jìn)行插入整合,PCR鑒定證實(shí)S基因已插入酵母菌的染色體中,分別命名為Z10-S/X-33株和L99-S/X-33株.重組菌株經(jīng)0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá),培養(yǎng)液上清