煙熏曲霉植酸酶基因phyA的克隆及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、植酸酶是一種能將植酸磷(六磷酸肌醇)降解為肌醇和無機磷酸的酸性磷酸酶類.在飼料中添加植酸酶不但可以提高動物對磷的吸收,降低環(huán)境中磷的污染,而且能解除植酸對金屬離子、氨基酸的螯合作用,大大提高飼料的利用效率.自然界中大量高活性的植酸酶主要存在于真菌中,大多數(shù)是絲狀真菌.國內外科技工作者對植酸酶基因克隆及其表達的研究已有許多成功的報道,大幅度提高了植酸酶的產(chǎn)量,并且實現(xiàn)了工業(yè)化的生產(chǎn).一般認為黑曲霉(Aspergillus niger)產(chǎn)生

2、的植酸酶活性最強,因此工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌中植酸酶基因大都來自于黑曲霉,但是這種來源于黑曲霉的植酸酶不能耐受較高的溫度,在干燥和制粒加工過程中酶活大量喪失.而煙熏曲霉(A.fumigatus)中分離的植酸酶能夠耐受90℃~100℃的高溫,并且能在較寬的pH范圍內降解植酸,具有較大的市場潛力.該研究根據(jù)已發(fā)表的植酸酶phyA基因全序列設計一對引物,用PCR方法從煙熏曲霉(A.fumigatus)CCTCC AF93024總DNA中擴增到去除

3、信號肽和內含子后約1.3kb的phyA基因編碼區(qū)片段,對該片段進行了克隆及序列測定.以此片段成功構建了pPIC9K-phyA表達載體,并轉化畢赤酵母GS115(Pichia pastoris).通過表達產(chǎn)物的酶活性檢測和SDS-PAGE電泳分析,重組轉化子中植酸酶得到了有效分泌和高效表達.搖瓶誘導發(fā)酵48h發(fā)酵液中植酸酶的活性可以達到113u/mL;表達產(chǎn)物在pH2.0~8.0均有活性,最適作用pH為6.0,最適作用溫度為60℃,并且具