植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、植酸酶近年來(lái)成為一種新型的綠色飼料添加劑，由于它能把植酸降解為肌醇和無(wú)機(jī)磷，可以提高飼料的利用率，降低成本，并減少對(duì)環(huán)境的污染，因而廣泛應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥工業(yè)以及環(huán)境保護(hù)。但由于天然植酸酶的熱穩(wěn)定性限制了植酸酶在生產(chǎn)用的應(yīng)用。解脂耶氏酵母可作為一種優(yōu)良的表達(dá)宿主，它被認(rèn)為是安全的，能用于食品和藥物生產(chǎn)中，并能利用很多普通的碳水化合物和脂肪作為碳源，使其更適合不同的工業(yè)應(yīng)用。本研究通過(guò)選用解脂耶氏酵母的表達(dá)載體PT14(改造的pINA

2、1296載體)和pINA1297，構(gòu)建出重組PT14-phyA和pINA1297-phyA解脂耶氏酵母菌株，期望能夠得到大量活性高及熱穩(wěn)定性好的重組酶。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有用PT14和pINA1297表達(dá)植酸酶phyA的報(bào)道。研究方法和內(nèi)容如下：
　　 1.植酸酶phyA基因的克?。豪寐然c法提取畢赤酵母GS115-phyA總基因組DNA，以其總DNA為模板，根據(jù)黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因序列設(shè)計(jì)出兩對(duì)引物，通過(guò)P

3、CR方法擴(kuò)增出不含有信號(hào)肽和內(nèi)含子的PT14phyA和1297phyA兩種植酸酶phyA片段，其中PT14phyA含有LacO編碼基因中的7個(gè)堿基，1297phyA片段中含有sfiⅠ和KpnⅠ兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。
　　 2.將擴(kuò)增出的PT1phyA片段與解脂耶氏酵母po1g的表達(dá)載體表達(dá)載體PT14進(jìn)行連接，構(gòu)建出重組表達(dá)載體PT14-phyA，PT14-phyA經(jīng)NotⅠ線性化用電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母po1g中，利用M

4、D和含有植酸鈣的PPB平板初篩出重組解脂耶氏酵母po1g。將篩選出的重組解脂耶氏酵母po1g接入到PPB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)的植酸酶酶活第四天時(shí)達(dá)到最大為22.75U/mL，表達(dá)的植酸酶最適pH值較高，經(jīng)過(guò)90℃處理10 min后還有62.47％的殘留活性，并且其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也較強(qiáng)。
　　 3.將擴(kuò)增出的1297phyA片段與解脂耶氏酵母po1h的表達(dá)載體表達(dá)載體pINA1297進(jìn)行連接，構(gòu)建出重組表達(dá)載

5、體pINA1297-phyA，pINA1297-phyA經(jīng)NotⅠ線性化后用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母po1h中，利用YNBcasa和含有植酸鈣的PPB平板初篩出重組解脂耶氏酵母po1h。將篩選出的重組解脂耶氏酵母po1h接入到Y(jié)M液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)的植酸酶酶活第六天時(shí)達(dá)到最大為636.23 U/mL。表達(dá)上清經(jīng)SDS-PAGE分析得到表達(dá)植酸酶分子量約為130 kD，但通過(guò)去糖基化處理后其分子量變?yōu)?1 kD，與理論值相