耶氏解脂酶母油脂積累分子機(jī)制的初步探索.pdf

1、目的：篩選得到產(chǎn)油含量較高的耶氏解脂酵母菌,在氮限制培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),檢測(cè)分析發(fā)酵過(guò)程中生化特征的變化,初步探討耶氏解脂酵母油脂積累的機(jī)制。
　　 方法：利用相同氮限制培養(yǎng)基篩選油脂產(chǎn)量高的耶氏解脂酵母菌株,測(cè)定不同碳源和氮源對(duì)油脂產(chǎn)量和生物量的影響;在氮限制培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基碳源和氮源的變化,并檢測(cè)酵母菌生物量、油脂含量及脂肪酸組成,同時(shí)用高效液相色譜法測(cè)定分泌到細(xì)胞外檸檬酸和異檸檬酸的含量。同時(shí)用分光光度

2、法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蘋(píng)果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶、AMP脫氨酶、NAD依賴型異檸檬酸脫氫酶、ATP檸檬酸裂酶的活性。
　　 根據(jù)NCBI公布的耶氏解脂酵母蘋(píng)果酸酶基因設(shè)計(jì)帶有BamH I酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物mae-F和mae-R,以基因組為模板擴(kuò)增基因全長(zhǎng),連入T載體,然后用限制性內(nèi)切酶BamH I同時(shí)酶切pMT-mae和空載體pET28a(+),回收所需片段用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建蘋(píng)果酸酶原核表達(dá)

3、載體pET28a-mae。將構(gòu)建完成的表達(dá)載體pET28a-mae轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),用IPTG誘導(dǎo)重組蘋(píng)果酸酶表達(dá),初步優(yōu)化表達(dá)條件,Ni-NTA親和層析柱純化蘋(píng)果酸酶重組蛋白質(zhì),測(cè)定重組蘋(píng)果酸酶對(duì)輔酶NAD和NADP的Km值。
　　 結(jié)果：初步篩選得到含脂量較高的Yarrowia lipolytica DSMZ1345,并選定甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)的碳源,酒石酸銨和酵母提取物作為發(fā)酵培養(yǎng)的氮源。Yarrowia,lip

4、olytica DSMZ1345在氮限制培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),氮源在7-8小時(shí)左右耗盡,此時(shí)生物量增加減緩而趨于穩(wěn)定,而油脂在氮源耗盡開(kāi)始積累,最高可達(dá)到細(xì)胞干重的18.1％,而其脂肪酸組成基本沒(méi)有變化。發(fā)酵過(guò)程中,酵母細(xì)胞將大量檸檬酸和異檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外,最終培養(yǎng)基中檸檬酸和異檸檬酸濃度達(dá)到51.79g/l和14.3g/l。N源耗盡時(shí),AMP脫氨酶活性增加而NAD依賴型異檸檬酸脫氫酶活性降低,這可能是酵母細(xì)胞油脂積累的開(kāi)始。細(xì)胞內(nèi)生成N

5、ADPH的三種酶蘋(píng)果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶的活性變化并沒(méi)有和油脂積累相關(guān)聯(lián)。ATP檸檬酸裂酶活性變化與油脂積累變化趨勢(shì)一致,可能是耶氏解脂酵母油脂積累的關(guān)鍵酶。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證蘋(píng)果酸酶在該酵母中的作用,我們構(gòu)建了耶氏解脂酵母蘋(píng)果酸酶表達(dá)載體pET28a-mae,BamH I和Sal I分別單酶切條帶正確,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)條件為溫度20℃,IPTG濃度

6、0.2 mM,誘導(dǎo)時(shí)間5 h,得到大量可溶性蛋白質(zhì),經(jīng)過(guò)Ni-NTA層析柱純化得到重組蘋(píng)果酸酶,在一定反應(yīng)體系中測(cè)得重組蘋(píng)果酸酶對(duì)NAD的Km為1.57 mM,Vmax為714.29nmol/min*mg,而重組蘋(píng)果酸酶雖能利用NADB但其對(duì)NADP的親和力很低,無(wú)法計(jì)算Km值。
　　 結(jié)論：耶氏解脂酵母能較好的利用甘油作為碳源積累生物量和油脂;耶氏解脂酵母在氮限制培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)直接進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,培養(yǎng)基中氮耗盡后酵母細(xì)胞能迅

7、速積累油脂,但油脂的積累量不高,而細(xì)胞能將大量檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外;ATP檸檬酸裂酶與油脂積累趨勢(shì)一致,可能是耶氏解脂酵母油脂積累的關(guān)鍵酶;成功構(gòu)建耶氏解脂酵母蘋(píng)果酸酶基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mae,并獲得高效表達(dá)重組蘋(píng)果酸酶的宿主菌BL21;重組蘋(píng)果酸酶在特定酶反應(yīng)體系下,對(duì)NAD的親和力較高,Km值為1.57 mM,Vmax為714.29nmol/min*mg,而重組酶對(duì)NADP的親和力較低,可能不是耶氏解脂酵母油脂積累的關(guān)鍵酶